Biotecnologie cellulari:

 
 
 
Biotecnologie cellulari
di Domenico Azarnia Tehran
 
Appunti sintetici che delineano le modalità di studio cellulare, sia per quanto
riguarda le colture cellulari, in particolare quella del lievito, che per la cattura di
quelle animali. Particolare attenzione viene data alle ricerche sulle cellule
staminali, su come si realizzano e sulle implicazioni etiche dell'argomento.
 
Università: Università degli Studi di Roma La Sapienza
Facoltà: Scienze Matematiche, Fisiche e Naturali
Corso: Scienze Biologiche
Esame: Biotecnologie cellulari
Docente: Tocco1. Le colture cellulari e le loro applicazioni
Prima dell'utilizzo, ogni nuovo composto sintetizzato deve sottostare all'approvazione da parte di organi
competenti, che ne autorizzano l'uso in seguito all'effettuazione di accurati studi di tossicità. Pertanto, è
necessaria da una sperimentazione che valuti gli eventuali effetti che composti a tossicità nota o
potenzialmente tossici, di origine naturale o artificiale, esercitano sugli organismi in seguito a contatto,
inalazione o ingestione. Le vie per effettuare la presenza di tossicità sono essenzialmente riconducibili a due
tipi di metodi: 1) metodi non biologici, che consistono in sistemi previsionali teorici (simulazioni, modelli
matematici) capaci di fornire rapidamente e con un costo contenuto, indicazioni di massima riguardanti la
tossicità di xenobiotici (sostanze estranee agli organismi) e 2) metodi biologici, che sono costituiti dai
metodi in vivo e dai metodi in vitro. I primi fanno uso di organismi nella loro integrità strutturale e
fisiologica; tramite questi metodi si effettuano quelli che vengono comunemente definiti “esperimenti sugli
animali”. I metodi in vitro costituiscono, invece, una sezione importante all'interno dei metodi biologici. Tra
essi si distinguono diverse categorie in base alla “porzione biologica” effettivamente utilizzata: si passa dalle
colture d'organo (che valutano l'influenza di tossici su una struttura ad un elevato grado di organizzazione
biologica), alle colture di tessuto (utili a verificare l'azione di xenobiotici in cellule tra loro comunicanti),
alle colture cellulari, che costituiscono il mezzo più utilizzato e conosciuti. Altri sistemi, soprattutto usati per
studi biomolecolari si basano sull'utilizzo di frazioni subcellulari (mitocondri, lisosomi, ecc.). Bisogna
specificare, che con le colture d'organo è possibile mantenere e sviluppare in vitro intere parti di organi; si
mantiene dunque una struttura di tipo organizzato. È un sistema più complesso rispetto alla coltura cellulare
e consente di studiare, ad esempio, gli effetti di sostanze tossiche sul differenziamento dei tessuti embrionali
e sulle funzioni dell'organo. Come le colture di tessuto di intende invece mantenere le interazioni tra le
cellule di un tessuto e studiarne i relativi processi. Sia le colture d'organo sia quelle di tessuto presentano, in
genere, una scarsa continuità nel tempo, per cui perdono rapidamente la loro organizzazione e tendono a
degenereare. Con le colture cellulari, invece, i problemi citati sopra sono in gran parte superati; esse
costituiscono un sistema molto omogeneo poiché tutte le cellule contraggono identici rapporti con
l'ambiente extracellulare rappresentato dal terreno di coltura. In tutti questi casi, comunque, si deve
considerare che, quando si parla di sistemi sperimentali, un fattore molto importante è costituito dalla
validazione dei test effettuati; è infatti necessario che i risultati ottenuti in un esperimento siano il più
possibile “validi” per lo scopo che lo studio si prefigge.  
Domenico Azarnia Tehran Sezione Appunti
Biotecnologie cellulari 2. Storia delle colture cellulari
La storia delle colture cellulari è relativamente recente. Nel XIX secolo Schleiden e Schwann ipotizzarono
che la cellula fosse un'unità funzionale vivente in grado di vita autonoma; tuttavia, ciò non condusse subito
ad effetti pratici nel campo della biologia sperimentale. Nel 1885, Wilhelm Roux condusse a termine con
successo i primi esperimenti di espianto mantenendo il cervello di un embrione di pollo in una soluzione
salina calda per pochi giorni. Agli inizi del XX secolo ebbero inizio i primi studi riguardanti l'ambiente
cellulare; numerosi ricercatori tentarono di isolare cellule dagli organismi e di mantenere in coltura
frammenti di tessuto vitali. In questi anni, ad esempio, fu effettuata per la prima volta una coltura in vitro di
frammenti di tessuto di rana e fu tentato il mantenimento di tessuto linfatico di crostacei. La scelta di questi
sistemi era basata sul fatto che tessuti di animali a sangue freddo non necessitavano di un mantenimento a
temperature diverse da quella ambientale. In passo più importante nello sviluppo di queste tecniche si ebbe
però nel 1943 quando Earle riuscì ad ottenere le prime linee continue di cellule di mammifero.
Successivamente, nel 1907, Harrison utilizzò come terreno di coltura il liquido linfatico, nel 1940 si
iniziarono ad aggiungere nel terreno di coltura antibiotici per evitare le contaminazioni, mentre nel 1952,
venne mantenuta in coltura la prima linea tumorale di origine umana (cellula HeLa). Inoltre, nel 1965, Ham
introdusse al terreno di coltura il siero, la componente non corpuscolare del sangue che contiene
macromolecole che garantiscono la vita delle cellule. Quindi, l'uso delle colture cellulari nella ricerca ha il
suo effettivo punto di partenza negli anni '50, anche se soltanto negli ultimi decenni esso è divenuto pratica
comune, essendo ormai possibile mantenere a lungo le cellule in coltura. Infatti, mentre i terreni di coltura
utilizzati un tempo consentivano la sopravvivenza cellulare soltanto per breve tempo, quelli attualmente in
uso presentano una ben maggiore complessità nella formulazione e contengono fattori di crescita specifici
per diversi tipi cellulari. Oggi è disponibile in commercio una notevole quantità di linee cellulari
stabilizzate, derivate da numerose specie diverse, le cui caratteristiche morfologiche, di crescita, genetiche e
la sensibilità sono ben conosciuti. Gran parte di queste linee cellulari provengono da mammiferi; tra queste
numerose sono quelle di origine umana che comprendono cellule normali e cellule tumorali. Utilizzando
queste cellule è possibile studiare moltissimi aspetti della biologia cellulare.
Domenico Azarnia Tehran Sezione Appunti
Biotecnologie cellulari 3. Vantaggi e limiti nell'uso delle colture cellulari
Le colture cellulari sono, sicuramente, il più promettente tra i modelli biologici, in quanto mostrano
caratteristiche indubbiamente vantaggiose. Uno dei vantaggi più rilevanti nell'uso delle colture cellulari è
relativo alla possibilità di studiare effetti tossici su cellule umane, ovviamente impossibile in vivo. Inoltre, le
colture cellulari sono poco costose, forniscono risultati in tempi brevi, possono essere esposte direttamente
alle sostanze da saggiare, possono rispondere anche a concentrazioni molto basse, poiché le sostanze nel
mezzo di coltura sono a contatto diretto con le cellule. Invece, un limite notevole riguarda la diversa
organizzazione tra un sistema sperimentale costituito da cellule isolate tra loro non comunicanti, e la
complessa organizzazione di un organismo nella sua interezza e complessità funzionale e strutturale. Inoltre,
si verifica la perdita di componenti (soprattutto quelli del sistema nervoso ed endocrino) coinvolti nella
regolazione omeostatica in vivo. Si presentano anche alterazioni metaboliche, caduta di livelli enzimatici,
variazione di cicli metabolici, selezione delle cellule più attivamente proliferanti. Particolare non
trascurabile infine, che può costituire a seconda dei casi un vantaggio o uno svantaggio, è la preparazione e
l'esperienza dell'operatore; le colture cellulari necessitano infatti si sterilità assoluta, in quanto una
contaminazione da batteri, muffe o lieviti conduce alla perdita della coltura stessa. Un altro problema delle
colture cellulari può riguardare l'aneuploidia di molte linee stabilizzate, che possono presentare corredo
cromosomico diverso dalle cellule di origine.  
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Biotecnologie cellulari 4. Colture cellulari primarie e colture stabilizzate
Una coltura cellulare deriva dalle cellule provenienti da un organo o da un tessuto. Tali cellule vengono
immesse in appositi recipienti (bottiglie, capsule, fiasche di coltura) contenenti un appropriato mezzo liquido
(terreno di colture) o semiliquido (gel) ed aderiscono al substrato o possono rimanere in sospensione. La
maggioranza delle cellule tendono comunque ad attaccarsi alla superficie del recipiente e solo così possono
sopravvivere e proliferare. In seguito alla proliferazione, le cellule giungono a contatto, occupando tutto lo
spazio disponibile, per cui costituiscono un “tappeto” unico e continuo che viene definito coltura
monostrato. Comunque, le cellule derivanti direttamente dal tessuto di origine costituiscono la coltura
primaria che mostra ancora affinità con il tessuto da cui proviene, ma presenta crescita e sopravvivenza
limitate. Si definisce, invece, coltura cellulare stabilizzata la condizione in cui è possibile mantenere e far
crescere indefinitamente le cellule in coltura. Nella coltura primaria sono presenti cellule di tipo diverso; in
seguito un tipo cellulare (in genere fibroblasti) tende a prevalere sugli altri. Si distinguono allora le linee
cellulari vere e proprie che possono essere: colture a vita finita, in cui la linea cellulare è costituita da cellule
con corredo cromosomico diploide e presenta una limitata possibilità di espansione nel tempo e sopravvive
per circa 50 espansioni successive e in seguito decade, colture continue, in cui le linee cellulari per
mutazione spontanea o ad opera di varie cause (radiazioni, virus, sostanze chimiche) hanno cellule che
possono replicarsi indefinitamente in coltura, e infine, colture clonali, che si ottengono per mitosi da
un'unica cellula e si usano quando è necessario avere un'elevata omogeneità tra le cellule. Un altra
distinzione tra le colture cellulari può essere fatta con altri discriminanti, e avremo: 
colture a breve termine e a lungo termine: nel primo caso le cellule si riproducono e poi muoiono, mentre
nel secondo caso le cellule si dividono illimitatamente (ad esempio le linee stabilizzate), o comunque vanno
incontro a molti cicli mitotici; 
colture in monostrato: in cui le cellule epiteliali e connettivali di molti tessuti aderiscono alla superficie del
recipiente che le contiene e l'adesione è necessaria alla sopravvivenza e alla proliferazione; successivamente
rallentano la propria crescita per fenomeni di inibizione da contatto, oppure si staccano; 
colture in sospensione: non necessitano di adesione al supporto (ad esempio cellule ematopoietiche o cellule
tumorali); 
colture massive: cellule di varia origine che si usano quando occorre un'elevata quantità di cellule (>109) ad
esempio per la produzione di vaccini; 
colture clonali: le cellule sono molto diluite e ognuna di esse si comporta come se fosse sola nel recipiente,
per cui può riprodursi e originare una colonia o clone che si definisce come “una popolazione cellulare
derivata da una singola cellula per mitosi”; 
co-colture: sono colture di cellule diverse coltivate nello stesso recipiente, ad esempio epatociti e fibroblasti,
ed è una tecnica utile per simulare un tessuto; 
colture istiotipiche: simulano la tridimensionalità usando sferoidi o supporti porosi, ad esempio filtri di
nitrocellulosa o policarbonato su cui le cellule si organizzano come in un tessuto; ciò si ottiene mantenendo
in agitazione le cellule in modo da facilitare la formazione di aggregati sospesi, anziché favorirne l'adesione
al substrato. 
Domenico Azarnia Tehran Sezione Appunti
Biotecnologie cellulari Se consideriamo l'andamento della coltura nel periodo che intercorre tra due successive espansioni si
osserva una iniziale fase di latenza immediatamente successiva all'espansione, che mostra un numero di
cellule stazionario; ciò avviene perché in questa fase le cellule devono assorbire lo stress conseguente alla
manipolazione subita. Nella fase di crescita esponenziale o log-phase, le cellule si replicano attivamente
aumentando rapidamente di numero. La fase stazionari ha luogo quando le cellule giungono a confluenza
(cioè “a contatto”), per cui lo spazio disponibile non è più sufficiente per successive replicazioni. A questo
punto le cellule non crescono più di numero o possono rendere ad “impilarsi” (quelle tumorali” perdendo la
caratteristica della coltura monostrato. In ogni caso, tendono a staccarsi dal substrato. Se non si interviene
con una nuova espansione si va incontro al decadimento della coltura. Comunque, le applicazioni delle
colture cellulari in vitro sono oggi molto numerose, tre le principali si annoverano: biologia cellulare
(controllo della crescita, del differenziamento, del metabolismo), biologia molecolare (espressione genica,
struttura del genoma), farmacologia e tossicologia (studi di meccanismi d'azione), genetica ( isolamento e
caratterizzazione di mutanti), oncologia (caratterizzazione dei tumori) e produzione di proteine (anticorpi
monoclonali e ibridomi).  
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Biotecnologie cellulari 5. Organizzazione di un laboratorio di colture cellulari
Il fattore più importante da considerare nell'organizzazione di un laboratorio che sia adibito alla
manipolazione delle colture cellulari è la sterilità. Pertanto l'ubicazione stessa del laboratorio deve essere
valutata attentamente al fine di ridurre il rischio di contaminazioni esterne. Nella situazione ottimale, un
laboratorio per colture cellulari dovrebbe essere il più possibile isolato dagli altri ambienti e situato in un
locale provvisto di aria filtrata. L'ingresso dovrebbe essere consentito solo agli operatori esperti e agli
addetti. La zona adibita alla manipolazione ed all'uso delle colture cellulari dovrebbe essere estremamente
pulita ed in condizioni di semi-sterilità. Invece, le dotazioni necessarie per l'allestimento di un laboratorio di
colture cellulari dovrebbero essere: cappe a flusso laminare, delle cappe in cui c'è un flusso di aria continuo
che passa attraverso un sistema di filtri che sterilizzano l'aria ( nelle cappe a flusso orizzontale, l'aria arriva
in “faccia all'operatore”, mentre nelle cappe a flusso verticale ( o biohazard) l'aria giunge dall'alto, per
questo l'apertura garantita al lavoro dell'operatore è maggiore nel secondo caso piuttosto che nel primo. In
entrambi i casi l'aria prima di uscire viene rifiltrata e questo è molto importante nel caso dell'utilizzo di
patogeni), incubatori, sia normali che a CO2, che permettono di mantenere le cellule in colture in quanto al
loro interno sono ricreate, nel limite possibile, le condizioni fisiologiche dei tessuti animali in cui le cellule
vivevano prima dell'isolamento. Quindi i parametri che vengono controllati sono la temperatura, la
concentrazione di CO2, il pH e l'umidità. Inoltre, vi è bisogno di microscopi rovesciati o ad ottica invertita
(invertoscopio), in cui la luce è posta in basso e garantisce di osservare un preparato anche molto sottile.
Abbiamo inoltre, pipette automatiche, apparecchiature per la sterilizzazione (stufa a secco, autoclave,
lampade UV, ecc.), sistemi per la conservazione delle cellule (congelatori e bidoni contenenti azoto liquido),
vetreria e materiale monouso, terreni di coltura liquidi o in polvere, e infine, additivi come il siero,
amminoacidi, ormoni, vitamine e fattori di crescita nonché sistemi tampone e antibiotici. 
Il fattore più importante da considerare nell'organizzazione di un laboratorio che sia adibito alla
manipolazione delle colture cellulari è la sterilità. Pertanto l'ubicazione stessa del laboratorio deve essere
valutata attentamente al fine di ridurre il rischio di contaminazioni esterne. Nella situazione ottimale, un
laboratorio per colture cellulari dovrebbe essere il più possibile isolato dagli altri ambienti e situato in un
locale provvisto di aria filtrata. L'ingresso dovrebbe essere consentito solo agli operatori esperti e agli
addetti. La zona adibita alla manipolazione ed all'uso delle colture cellulari dovrebbe essere estremamente
pulita ed in condizioni di semi-sterilità. Invece, le dotazioni necessarie per l'allestimento di un laboratorio di
colture cellulari dovrebbero essere: cappe a flusso laminare, delle cappe in cui c'è un flusso di aria continuo
che passa attraverso un sistema di filtri che sterilizzano l'aria ( nelle cappe a flusso orizzontale, l'aria arriva
in “faccia all'operatore”, mentre nelle cappe a flusso verticale ( o biohazard) l'aria giunge dall'alto, per
questo l'apertura garantita al lavoro dell'operatore è maggiore nel secondo caso piuttosto che nel primo. In
entrambi i casi l'aria prima di uscire viene rifiltrata e questo è molto importante nel caso dell'utilizzo di
patogeni), incubatori, sia normali che a CO2, che permettono di mantenere le cellule in colture in quanto al
loro interno sono ricreate, nel limite possibile, le condizioni fisiologiche dei tessuti animali in cui le cellule
vivevano prima dell'isolamento. Quindi i parametri che vengono controllati sono la temperatura, la
concentrazione di CO2, il pH e l'umidità. Inoltre, vi è bisogno di microscopi rovesciati o ad ottica invertita
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Biotecnologie cellulari (invertoscopio), in cui la luce è posta in basso e garantisce di osservare un preparato anche molto sottile.
Abbiamo inoltre, pipette automatiche, apparecchiature per la sterilizzazione (stufa a secco, autoclave,
lampade UV, ecc.), sistemi per la conservazione delle cellule (congelatori e bidoni contenenti azoto liquido),
vetreria e materiale monouso, terreni di coltura liquidi o in polvere, e infine, additivi come il siero,
amminoacidi, ormoni, vitamine e fattori di crescita nonché sistemi tampone e antibiotici.
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