Espressione genica in sistemi eterologhi

Il problema di esprimere geni in sistemi eterloghi nasce dall'interesse generale di ottenere grandi quantità di peptidi di interesse pratico o scientifico e dalla difficoltà di esprimere geni, di qualunque natura,in organismi superiori assai complessi e soggetti a regolazioni non sempre pienamente comprese. Al contrario, invece, il livello di conoscenze accumulate su alcuni organismi “semplici”, specialmente procariotici, ha stimolato lo sviluppo di numerosi sistemi di espressione eterologhi basati essenzialmente sull’utilizzo di appositi vettori di espressione. E’ virtualmente possibile esprimere geni in sistemi di ogni tipo utilizzando vettori d’espressione appropriati,in funzione di esigenze specifiche. I più diffusi sono Escherichia coli, Bacillus subtilis, lievito, cellule d’insetto, cellule vegetali e cellule di mammifero in coltura. L’espressione in E.coli è di gran lunga la più semplice e, forse, per questo la più utilizzata come prototipo di espressione genica in sistemi eterologhi. Le conoscenze correnti permettono di sfruttare le potenzialità dell’espressione genica in organismi complessi che, sempre più spesso vengono utilizzati come bioreattori. Come sappiamo i segnali che assicurano l'espressione genica nei procarioti sono molto diversi e se un gene eucariotico viene semplicemente trasferito in una cellula batterica ha poche probabilità di essere espresso. Quindi, costruire un vettore d'espressione significa essenzialmente costruire un vettore di replicazione contenente tutti quei segnali capaci di ottimizzare la corretta trascrizione e traduzione dei geni eterologhi nell'ospite in cui avviene l'espressione. Per aumentare le rese, infine, in genere si cerca di ottimizzare la stabilità dei prodotti di espressione, sia a livello trascrizionale che traduzionale. In genere, il livello di espressione di un gene dipende in larga misura dalla forza del promotore che lo controlla determinando la frequenza con la quale la RNA polimerasi inizia la trascrizione. Sono stati quindi isolati ed ottimizzati un certo numero di promotori forti di E.coli che sono presenti nella maggior parte dei vettori d’espressione attuali. In più, poiché il livello di conoscenza dei promotori procariotici e’ molto avanzato, sono stati costruiti anche promotori in parte o totalmente sintetici sulla base delle sequenze consenso ottimali. Un promotore procariotico tipico e’ costituito da circa 60 bp contenenti due sequenze consenso a -35 (TTCAGA) e -10 (TATAAT). La spaziatura tra questi elementi e importante quanto la sequenza stessa. In alcuni promotori sono state caratterizzate recentemente regioni “up” ulteriormente a monte che aumentano l’efficienza di trascrizione L’inizio della traduzione in E.coli richiede la presenza, sulla porzione non tradotta al 5' dell'mRNA, di una regione di legame al ribosoma (RBS). Nei batteri e costituita da una sequenza, chiamata Shine-Dalgarno (SD). La sua sequenza consenso e: 5'-UAAGGAGG-3'. Subito dopo la sequenza di Shine-Dalgarno deve essere presente un codone di inizio, quasi sempre AUG. Anche la composizione della tripletta immediatamente precedente l’AUG e rilevante. Per alcuni geni, come ad esempio la β-galattosidasi sono stati sistematicamente cambiate le basi vicine all’AUG rivelando variazioni di stabilita fino al 20%. La spaziatura ottimale tra SD e AUG e di 8 bp
E’ importante che la sequenza nucleotidica tra la SD e il codone d’inizio non sia disturbata da strutture secondarie (come le stem loops) che possono interferire drasticamente con il legame al ribosoma e la conseguente traduzione. Infine, la resa di un prodotto di espressione dipende, in larga misura, dalla stabilita della proteina.  Sappiamo che la stabilita delle proteine dipende dalla presenza di aminoacidi stabilizzanti all'estremità N-terminale e di amminoacidi destabilizzanti all'estremità C-terminale. Modificando, tramite ingegneria genetica, la sequenza codificante una proteina, possiamo alterarne la composizione amminoacidica ed aumentarne la stabilita. Ad esempio, le sequenze PEST, ricche in prolina (P), acido glutammico (E), serina (S) e treonina (T), spesso fiancheggiate da gruppi di amminoacidi positivi, sono target di degradazione e destabilizzano le proteine batteriche che le contengono. L’eliminazione delle sequenze PEST, mediante mutagenesi sito-specifica, può migliorare la stabilita delle proteine ricombinanti Sapendo inoltre che organismi diversi possono utilizzare preferenzialmente codoni sinonimi per specificare uno stesso amminoacido e poiché e nota la percentuale di utilizzazione media dei codoni sinonimi in molti organismi e possibile aumentare il livello d’espressione modificando i codoni del gene di interesse senza alterarne il prodotto d’espressione. Un altro modo per ottimizzare la stabilità dei prodotti d’espressione, consiste nel minimizzare la degradazione proteolitica a carico delle proteine espresse A causa della presenza in E.coli di più di venti proteasi, solo alcune delle quali caratterizzate, questo obiettivo e difficile da ottenere. Sono tuttavia disponibili ceppi di E.coli mutanti che risultano difettivi in una o più di queste proteasi.