Il terreno di coltura cellulare

Le cellule, isolate dai tessuti con mezzi meccanici o enzimatici, devono essere messe in terreni di coltura che permettono la loro crescita. 
Questi terreni contengono infatti, molti prodotti necessari alla crescita cellulare e al mantenimento delle condizioni fisico-chimiche quali il pH e l'osmolarità. 
Le sostanze nutritizie sono quelle che vengono utilizzate dalle cellule, ma che esse non possono sintetizzare. 
Sono dunque essenziali per le cellule e comprendono: gli amminoacidi, le vitamine (che vengono usate soprattutto quando vi sono basse concentrazioni di siero), i gas disciolti, gli ioni (che servono a mantenere i potenziali di membrana e per il bilancio osmotico nonché il pH a 7), il carbonio organico (sotto forma di glucosio o glutamina), lipidi (come i fosfolipidi e i trigliceridi che molto spesso si trovano nel siero e quindi non vengono aggiunti), ormoni (come l'insulina, il glucagone o il progesterone che sono, però, contenuti già nel siero e quindi vengono aggiunti solo in mancanza del precedente), fattori di crescita (come l'EGF, epidermal growth factor e l'FGF, fibroblast growt factor, che hanno la funzione di stimolare la proliferazione cellulare) , antibiotici (per prevenire eventuali contaminazioni batteriche) ed  elementi in traccia (come ferro, zinco, selenio). 
Le cellule, come sappiamo, crescono bene a pH 7,4, per questo i terreni sono addizionati di rosso fenolo, un indicatore di pH che è giallo a pH 6,5, arancio a pH 7,0, rosso a pH 7,6 e violaceo man mano che si sale. Siccome è molto difficile la scelta di un terreno, in quanto bisogna considerare molti fattori come il tipo cellulare utilizzato e le sue esigenze metaboliche e nutrizionali, uno degli approcci possibili è quello di cominciare ad usarne uno particolarmente ricco, come l'HAM's F 10, con un'alta concentrazione di siero, e quindi di ridurre gradualmente la quantità di siero eliminandolo, aggiungendo o modulando i singoli componenti fino ad arrivare ad un terreno relativamente semplice come il “Basal Medium of Eagle”. 

Oggi si utilizzano terreni che richiedono l'aggiunta di siero (2-20%) o terreni, detti definiti o sintetici, che non richiedono l'aggiunta di siero, in quanto contengono fattori di crescita purificati. Comunque entrambi i tipi di terreno devono avere i seguenti requisiti: 1) fornire vitamine e minerali in traccia e ioni inorganici, 2) mantenere i parametri fisiologici e 3) non essere tossici per le cellule. Comunque, il siero è una variabile molto importante per la sua natura complessa; esso è una miscela di: fattori chi crescita che favoriscono la proliferazione cellulare, fattori di adesone come la fibronectina, ormoni, trasportatori, come la trasfererrina, che trasporta il ferro all'interno della cellula, ed elementi minerali in tracce utili come cofattori di enzimi cellulari (Cu, Fe, Zn, ecc.). Oggi sono disponibili molti terreni che non richiedono l'agggiunta del siero; spesso però questo è indispensabile, in quanto alcune cellule, per la loro sopravvivenza e per la loro crescita, lo richiedono. 
I sieri più comunemente usati sono il siero bovino fetale, che contiene una maggiore concentrazione di fattori di crescita, il siero di cavallo adulto e il siero umano. Esistono disparità di prezzi e qualità, ma un requisito indispensabile è che il siero sia stato saggiato per l'assenza di micoplasmi e dei virus bovini più comuni. Quindi le principali funzioni del siero sono: stimola le funzioni e la crescita cellulare tramite fattori ormonali, stimola l'adesione al substrato con formazione di una biomatrice e provvede al trasporto di ormoni, minerali e lipidi.  In molti casi un terreno molto "generale" o molto semplice e' adeguato. Il primo terreno a composizione definita e' stato il BME o Eagle's Basal Medium. E' usato comunemente per cellule adese (o in monostrato) come ad es. le cellule HeLa e alcune cellule primarie. 

Altri terreni sono stati sviluppati a partire da questo, come ad esempio il DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium), che prevede una maggiore quantità di vitamine e aminoacidi rispetto al BME, e venne inizialmente usato per cellule embrionali di topo. Oggi e' un terreno tra i piu' utilizzati, specialmente per cellule adese. MEM (Minimum Essential Medium) e' stato messo a punto per cellule più esigenti per le quali il BME non andava bene. Si puo' notare che piu' che altro mancano alcuni costituenti ed e' piu' povero di glucosio. MEM e' molto utilizzato per le colture di cellule primarie. Per le colture di cellule aderenti di solito si utilizzano terreni con un relativamente alto contenuto di Ca2+ e Mg2+, che sono necessari per le proteine di adesione. Le cellule in sospensione di solito non richiedono queste stesse alte concentrazioni, e si utilizzano quindi terreni più "poveri" in questi cationi come ad es. l'RPMI 1640 (Rosewell Park Memorial Institute 1640 Medium), che e comunemente usato per le cellule della linea bianca del sangue sia umane che murine, sia normali che trasformate. Comunque l'RPMI e', insieme al DMEM uno dei terreni più utilizzati, anche per cellule adese. Una volta preparato il terreno "base", vi si dovranno aggiungere alcuni elementi prima di poterlo utilizzare per le colture.