Modalità di conteggio cellulare nelle colture

Le cellule in coltura vanno contate sia ogni volta che si dividono le colture, che per scopi che riguardano gli esperimenti.
Il conteggio delle cellule viene fatto o manualmente al microscopio con un emocitometro oppure con sistemi automatizzati come il Coulter Counter. Il sistema automatizzato ha il vantaggio di una alta velocità di conta e di una elevata accuratezza e precisione. Ha pero' il grosso svantaggio che non discrimina ne' le cellule morte dalle vive, ne' diversi tipi cellulari tra di loro .
Un emocitometro e' formato da uno speciale vetrino portaoggetti con opportuno coprioggetto, e la conta viene effettuata utilizzando un microscopio. Questo tipo di conteggio e’ ovviamente più faticoso e più lento, ma ci permette di osservare l'aspetto (e quindi lo stato) delle nostre cellule. L'accuratezza della conta ottenuta in questo modo e' più che sufficiente per quasi tutti gli scopi sperimentali. Per valutare la vitalità cellulare si usa di solito la colorazione con Trypan blu, che e' un colorante che e' escluso dalle cellule vitali. Solo le cellule con la membrana permeabilizzata (e quindi morte) risulteranno blu. Per avere un conteggio che sia rappresentativo del nostro campione, e' ovviamente necessario partire da una sospensione cellulare omogenea. Per contare le cellule in sospensione e’ sufficiente risospenderle bene con una pipetta, dato che tendono comunque a sedimentare sul fondo della fiasca, e che spesso possono crescere formando degli aggregati. L'aspirazione e l'espulsione del liquido vanno fatti con molta delicatezza, senza fare schiuma, che e' indice di denaturazione delle proteine (del siero) e anche di lisi cellulare. Un buon sistema e' quello di espellere il liquido lentamente contro la parete della fiasca: questo dovrebbe aiutare a disaggregare eventuali aggregati. Un piccolo volume della sospensione (circa 100 μl) viene prelavato con una pipetta sterile, e mescolato con un volume uguale di una soluzione di Trypan blu allo 0.5 %. Bisogna fare attenzione che i volumi di cellule e di trypan siano effettivamente uguali o per lo meno perfettamente noti, perché dobbiamo calcolare la concentrazione di cellule nella sospensione di partenza e dobbiamo conoscere l'esatta diluizione operata. Per contare le cellule adese bisogna staccarle dal fondo della fiasca (o del contenitore usato) in modo pero' da avere una sospensione rigorosamente unicellulare. Questo viene fatto di solito utilizzando una soluzione di tripsina/EDTA. Questo procedimento viene detto tripsinizzazione della coltura. La tripsina e' un'enzima proteolitico che ha la funzione di digerire le proteine della matrice extracellulare che permettono l'attacco delle cellule al substrato. E' utilizzata di solito una soluzione madre 1:250, dicitura che indica una soluzione in cui, nelle condizioni in cui il test viene eseguito, 1 g di tripsina digerisce 250 g di substrato. Oltre alla tripsina, questa soluzione contiene di solito EDTA (acido etilendiaminotetraacetico) allo 0.02%. L'EDTA e' un chelante del Ca2+ e del Mg2+. Questi cationi, ma specialmente il calcio, sono indispensabili per le proteine di adesione, e quindi la tripsina e l'EDTA sono usati insieme. L'attività della tripsina e' inibita dal siero, che contiene degli inibitori della tripsina; nel caso si utilizzino terreni senza siero, e’ necessario ricorrere a soluzioni di inibitori, come ad esempio l’inibitore della tripsina estratto dalla soia. Vi sono casi dove l'utilizzo della tripsina per staccare le cellule non e' raccomandato: alcuni tipi di cellule difatti richiedono altri enzimi proteolitici, come ad esempio pronasi, dispasi o collagenasi. Tuttavia, al contrario della tripsina, non abbiamo inibitori nel siero per questi tipi di enzimi, per cui è necessario allontanarli dalla sospensione cellulare mediante centrifugazioni e lavaggi. Per cellule poco aderenti (come le HeLa-S3, che possono crescere sia in sospensione che adese), può essere sufficiente pipettare con un po’ di forza il terreno sulla superficie della fiasca, oppure il lavaggio con PBS o PBS/EDTA allo 0,02%. Altre cellule molto aderenti si staccano difficilmente o si staccano a grappoli con la classica soluzione di tripsina: in questi casi si possono utilizzare soluzioni contenenti citrato ed EDTA.. Infine, dato che gli enzimi proteolitici possono digerire in parte anche le proteine di superficie, nel caso che siano proprio queste il nostro oggetto di studio, e’ preferibile staccare le cellule con mezzi meccanici, come gli “scraper” o i “rubber policemen” , che però non ci consentono di ottenere sospensioni monocellulari adatte alla conta o ad alcune applicazioni analitiche. In alternativa, si può tentare una tripsinizzazione a 4°C, dato che il freddo dovrebbe salvaguardare maggiormente l’integrità di membrana.  Vi sono diversi modelli di emocitometri, tra i quali i più usati sono le camere di Burker e quelle di Neubauer. Sono costituiti da un portaoggetti sul quale sono incise tre profonde scanalature che dividono la parte centrale in due aree isolate che costituiscono le camere di conta. Su queste aree sono disegnate delle griglie, che delimiteranno le aree in cui contare le cellule. Sia nella Burker che nella Neubauer il vetrino coprioggetto, una volta posizionato correttamente, delimita uno spessore di 0.1 mm. Il vetrino coprioggetto viene montato prima di inserire il campione, e se la camera e' senza morsetti di bloccaggio (e comunque si può' fare anche con i morsetti) per essere sicuri che il coprioggetto sia perfettamente aderente si bagnano le due corsie laterali con pochi microlitri di acqua e si appoggia il coprioggetto premendo. A questo punto con una pipetta Pasteur o con una micropipetta automatica si appoggia una goccia del campione sulla camera proprio contro il bordo del coprioggetto. La goccia viene risucchiata per capillarità nella camera, e l'eventuale surplus cade nelle scanalature. E' importante evitare di sporcare il coprioggetto. Nella camera di Burker, la griglia delimita con 3 linee ravvicinate un grande quadrato diviso in 9 quadrati più piccoli (ciascuno delimitato da 2 linee ravvicinate), ciascuno dei quali e' diviso ulteriormente in una serie di quadrati maggiori, dei quadrati piccolissimi e dei rettangoli, tutti delimitati da una singola linea. A ciascun poligono corrisponde una certa area. Trascurando Ie figure più piccole (i quadratini e i rettangoli) e' importante sapere che i quadrati "a un solo bordo" corrispondono ad un area di 0.04 mm2 e quindi dato che lo spessore è di 0.1 mm delimitano un volume di 0.004 mm3 cioe' di 1/250 μl. I quadrati "a due bordi" invece racchiudono un'area totale (compresi i quadratini piu' piccoli e i rettangoli) di 1 mm2 e quindi delimitano un volume di 0.1 μl. Vi sono diversi modi per contare le cellule: uno e' quello di contare i quadrati

"a un solo bordo" situati sulle diagonali di ciascuna griglia, cioè 12 quadrati per diagonale, quindi 24 quadrati per griglia. In questo modo si minimizzano eventuali disomogeneità di distribuzione delle cellule nella camera. A questo punto si calcola il numero medio di cellule per quadrato e, sapendo che ogni quadratino corrisponde ad 1/250 di μl e che si sono diluite le cellule 2 volte con il trypan, si moltiplica il numero medio di cellule per quadrato per 250 (in modo da avere le cellule per microlitro della soluzione diluita), per due (per avere le cellule per microlitro della sospensione originale) ed infine per mille: in questo modo si hanno la cellule per ml della sospensione originale. Se si sono fatte altre diluizioni bisogna ancora moltiplicare per i fattori di diluizione utilizzati. Ovviamente se si desidera sapere la quantità totale delle cellule in fiasca bisogna infine moltiplicare per il volume della sospensione cellulare. Un'altra scuola conta tutte le cellule presenti in un quadrato "a doppio bordo", possibilmente quello centrale. Questo quadrato corrisponde a 0.1 μl, quindi basta moltiplicare per 10.000 per avere le cellule per ml della sospensione diluita. Bisognerà poi tenere conto delle diluizioni operate, sia con il trypan che con altri diluenti. Se le cellule sono poche, o se si vuole una conta più accurata, si contano più quadrati, anche se e' statisticamente più corretto allestire più campioni da contare perlevando più volte dalla nostra fiasca. Nella camera di Neubauer la grigliatura e' leggermente diversa, formando sempre 9 quadrati medi ma i quadrati di conta sono i 5 disposti a croce, cioè i centrali. Ciascuno di essi racchiude un volume di 0.1 μl, per cui basta moltiplicare per 10.000 per avere le cellule per ml. Valgono tutte le osservazioni fatte per la camera di Burker.  Per contare al microscopio, dato oltretutto che i vetrini coprioggetto degli emocitometri sono molto cari (devono ovviamente essere perfettamenti piani, per non racchiudere diversi volumi in divere aree delle griglie) è bene abituarsi a cercare il fuoco con cautela. Il sistema migliore e' quello di portare l'obiettivo (10 X) quasi a contatto con il vetrino guardando il tutto e non dentro al microscopio, quindi sistemarsi comodamente al microscopio e allontanare lentamente l'obiettivo dal vetrino fino a trovare la griglia.