Virologia molecolare:
Disciplina biomedica che ha come oggetto lo studio dei virus. La virologia è determinante per il chiarimento di problemi di biologia generale e per l’approfondimento di conoscenze in campi diversi come la struttura del gene, la mutagenesi chimica e fisica, la ricombinazione genetica, il controllo dell’espressione genica e delle sintesi enzimatiche, la natura di alcuni tipi di cancro e la patogenesi di numerose malattie infettive, la ricerca sui farmaci e sui nuovi vaccini antivirali.
Dettagli appunto:
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Autore:
Simone Pisu
[Visita la sua tesi: "Caratterizzazione molecolare ed eterogenicità delle varianti emoglobiniche in Sardegna"]
- Università: Università degli Studi di Cagliari
- Facoltà: Biologia
- Corso: Biologia Cellulare e Molecolare
- Esame: Virologia molecolare
- Docente: Prof. Marongiu
Indice dei contenuti:
- 1. Che cos’è un virus?
- 2. Caratteristiche salienti dei virus
- 3. Virus e malattie umane
- 4. La risposta innata ai virus
- 5. Il virus dell'influenza
- 6. Il Rinovirus
- 7. Il virus del morbillo
- 8. I virus a trasmissione orale: l'epatite A
- 9. Gli Adenovirus
- 10. I Rotavirus
- 11. Il virus dell'epatite B
- 12. Il virus dell'epatite C
- 13. I Retrovirus
- 14. Descrizione del genoma dei retrovirus
- 15. Il ciclo replicativo dei retrovirus
- 16. HTLV-1
- 17. I virus a trasmissione sessuale
- 18. Herpes simplex 1 e 2
- 19. L'HIV
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Virologia molecolare di Simone Pisu Disciplina biomedica che ha come oggetto lo studio dei virus. La virologia è determinante per il chiarimento di problemi di biologia generale e per l’approfondimento di conoscenze in campi diversi come la struttura del gene, la mutagenesi chimica e fisica, la ricombinazione genetica, il controllo dell’espressione genica e delle sintesi enzimatiche, la natura di alcuni tipi di cancro e la patogenesi di numerose malattie infettive, la ricerca sui farmaci e sui nuovi vaccini antivirali. Università: Università degli Studi di Cagliari Facoltà: Biologia Corso: Biologia Cellulare e Molecolare Esame: Virologia molecolare Docente: Prof. Marongiu1. Che cos’è un virus? Un virus è costituito da un pezzo di Rna o Dna racchiuso in un involucro proteico. I virus più semplici hanno soltanto un genoma, rivestito da un capside proteico, e infatti capside è il nome che diamo a quelle proteine che formano il guscio che racchiude il genoma. Come si sono evoluti i virus? I virus sono parassiti intracellulari obbligati, necessitano per potersi replicare di una cellula ospite che supporti la loro replicazione. Non è però che vivano sempre all’interno di una cellula dove possono Simone Pisu Sezione Appunti Virologia molecolare riprodursi, ma esistono anche allo stato extracellulare dove però, sono delle particelle assolutamente quiescenti che riescono a sopravvivere: è quel momento in cui un virus, uscito da una cellula dove si era riprodotto, è in ambiente cellulare; tutto si ferma, è metabolicamente inerte, ha la possibilità però di infettare una nuova cellula per riprendere cosi un nuovo ciclo replicativo. I virus più piccoli, hanno un genoma e proteine che formano il capside. Tra di questi abbiamo: i virus responsabili della poliomelite. Vengono chiamati nudi per distinguerli da un altro gruppo di virus che, all’esterno del capside presentano un ulteriore rivestimento al quale diamo il nome di envelope o involucro pericapsidico. Questi sono virus rivestiti, perché presentano l’envelope, rivestiti se paragonati rispetto ai virus nudi che sono privi di questo ulteriore strato esterno che i virus acquisiscono quando fuoriescono dalla cellula ospite Abbiamo qui alcuni esempi, come virus rivestiti, il virus dell’epatite B, dell’influenza e l’HIV. Come virus nudi, ossia privi di un rivestimento: il papilloma e il poliovirus. Simone Pisu Sezione Appunti Virologia molecolare 2. Caratteristiche salienti dei virus Innanzitutto i virus sono caratterizzati da delle dimensioni estremamente ridotte, siamo nell'ordine del nanometro, i virus più piccoli come i poliovirus hanno un diametro di circa 20 nm. I virus più grandi arrivano ad avere una dimensione più grande di circa 500 nm. Siamo al di sotto dei limiti di risoluzione per il microscopio ottico, di conseguenza, se noi vogliamo osservare un virus dobbiamo ricorrere a un microscopio elettronico. Per farvi entrare in questo ordine di grandezza, 1 nm corrisponde a 10 metri, quindi delle misure estremamente ridotte. Non c'è assolutamente nessuna proporzione tra una struttura cosi semplice e il guaio che possono causare. Il più piccolo, di informazione genetica, tra i virus umani è l'epatite B, a dispetto di una pochezza incredibile di informazione genetica per malattie epatiche associate all'infezione di questo virus: muoiono 1 milione di persone all'anno. In questa diapositiva, un virus è 10 più piccolo di un pallone, il quale è a sua volta 10 più piccolo del globo terrestre. Quindi, prima caratteristica saliente e importante per poter capire tutte le successive caratteristiche di questi virus sono le loro dimensioni estremamente ridotte. Ma forse la caratteristica più saliente è questa, i virus sono dipendenti da una cellula vivente per la loro replicazione: in ambiente extracellulare un virus che è quiescente, deve, trovando specifici recettori attaccati alla cellula, entrarvi dentro e riuscire così a replicarsi. Perché un virus dipende dalla cellula ospite? Perché, innanzitutto manca di quelli che sono gli elementi base necessari per la replicazione e che sono invece presenti in tutte le cellule che, al contrario, sono capaci di farlo. Il virus manca di quegli enzimi che sono indispensabili per la sintesi, di tutti quei precursori che partecipano alle sintesi macromolecolari, i virus non sanno sintetizzare nucleotidi, non sanno sintetizzare carboidrati, non sanno sintetizzare lipidi ne tanto meno amminoacidi, ecco che questo è un motivo fondamentale per il quale il virus dice alla cellula “aiutami vienimi incontro perché certo io non posso affrontare una sintesi proteica se non so prepararmi tutti quei mattoni che sono indispensabili per affrontare un simile processo”. Sono privi di tutti quei sistemi enzimatici che generano, normalmente sottoforma di ATP, energia chimica utilizzabile, ecco che ancora una volta il virus ricorre alla cellula per produrre tutta quella energia che serve per lo svolgimento delle sintesi virus specifiche. Manca di ribosomi, di RNA transfer, come pure di tutto quel macchinario enzimatico che è indispensabile perché all'interno di una cellula si sintetizzi una proteina. Manca di membrane, che sono la sede di tutte le sintesi macromolecolari normalmente realizzate all'interno di una cellula. Tutti e 5 motivi fondamentali che ci spiegano perché un virus all'esterno di una cellula è incapace di andare incontro a qualsiasi tipo di sintesi macromolecolare. Un'altra caratteristica è che un virus penetrato in una cellula, che vuole intraprendere un proprio Simone Pisu Sezione Appunti Virologia molecolare processo replicativo, perde la propria integrità. Sapete dalla microbiologia, quando vi ho detto parassiti intracellulari obbligati che questa non è una caratteristica unica dei virus, ci sono anche cellule batteriche come per esempio le clamidie che replicano solo all'interno di una cellula. Ma che caratteristiche hanno questi procarioti? Vivono all'interno di una cellula ma sono capaci di una crescita alla quale segue una normale divisione in due cellule figlie, sono microrganismi che nel loro processo di crescita che culmina in un processo di divisione, non perdono la loro integrità. Ben diverso è il comportamento dei virus: subito dopo che un virus è riuscito a penetrare all'interno di una cellula, o proprio durante questo processo di penetrazione, il virus in un processo chiamato UNCOATING si spoglia, si ha separazione tra il genoma e quelli che sono i rivestimenti superficiali del virus. Ecco che, a questo punto, il genoma virale diventa la centralina che dirige la replicazione e la formazione di una nuova progenie virale. E che sintesi dovrà dirigere, questo genoma, per arrivare alla formazione di nuove particelle virali? Deve fare due cose: tanti nuovi genomi e tante nuove proteine strutturali che, in una tappa, che poi è la tappa finale del ciclo replicativo si assemblano insieme per formare nuove particelle virali. Lo vediamo meglio nella successiva diapositiva, a sinistra abbiamo una tipica curva di crescita di una cellula batterica: inizia con un periodo di latenza nella quale la cellula batterica si fornisce tutte le attività enzimatiche che sono indispensabili alla sua crescita e successiva divisione. Una volta che questo è realizzato abbiamo, una fase esponenziale, nella quale le cellule batteriche replicano, fino a che, esauriti i nutrimenti a disposizione si entra in una fase stazionaria che precede l’ultima fase che è quella di morte. In tutte queste fasi la cellula batterica è una cellula completa integra che, quando cresce e si divide nella fase esponenziale da una cellula se ne originano altre due. Completamente diverso il comportamento replicativo da parte di un virus, ovviamente tutte le volte che voglio coltivare un virus in laboratorio devo avere a disposizione cellule. Nessun tipo di terreno ha la possibilità di supportare la replicazione di questi microrganismi essendo intracellulari obbligati. Cosa succede quando io infetto delle cellule con un virus? Lascio passare un certo periodo, pochi minuti, frammento quelle cellule, le apro, per vedere quello che c’è Simone Pisu Sezione Appunti Virologia molecolare dentro, non trovo più particelle virali complete. Il virus a seguito dell’uncoating si è svestito, vedo che questo periodo dura un certo tempo prima che si possano di nuovo riscontrare in quella cellula particelle virali complete. Che cosa fa il virus in questo periodo di latenza? Vuole fare tanti nuovi genomi e sintetizzare proteine capsidiche, poi le acchiappa le mette insieme e si formano nuove particelle virali. Cosa vuole fare? Prima di tutto deve pensare a procurarsi quegli enzimi che gli servono per duplicare il proprio dna, e anche quelle attività enzimatiche che gli consentono di contrattare la cellula. Cosa vuol dire contrattare? Il virus entra all’interno di una cellula e dice, a questo punto la centralina di questa cellula che detta ordini è il mio genoma. Molto spesso un virus deve aver evoluto delle modalità che gli consentono di prendere il sopravvento su quelle che sono le sintesi molecolari della cellula ed è quello che fa con quelle che sono le proteine virali precoci. Dopo di che pensa a replicare il proprio genoma, quando ha replicato il proprio genoma sullo stampo di questi nuovi genomi si sintetizza le proprie proteine capsidiche ed eventuali altre proteine strutturali. A questo punto ha a disposizione nuovi genomi, nuove proteine strutturali ed ecco che il periodo di latenza finisce, avviene l’assemblaggio, e nuove particelle virali, potranno, se noi tramutiamo quella cellula prima che il virus sia fuoriuscito in ambiente extracellulare, ritroviamo nuovamente particelle virali. Osserviamo le fasi dell’infezione del fago T4. È un batteriofago, ossia un virus che ha come ospite una cellula batterica, che realizza il proprio ciclo replicativo in 25 minuti ma lo fa con una intelligenza che lascia sbalorditi, si è organizzato per fare ogni cosa al momento opportuno. È importante sottolineare come un microrganismo cosi piccolo possa, passo dopo passo, fare tutto quello che gli serve e, una volta per esempio, quando una attività enzimatica ha cessato di essergli utile ne stoppa la produzione. Il virus è utilizzato, quindi, per infettare la cellula ospite. Si tratta di cellule di E.coli e cosa fa nella fase di latenza, nella quale se noi rompiamo quell’E.coli non vediamo più batteriofagi integri? Penetra nella cellula solo il genoma, il quale sintetizza prima degli Rna messaggeri che chiamiamo precoci, che servono al virus per duplicare il Dna genomico. Dopodiché con una serie di messaggeri che portano alla sintesi di proteine intermedie, è pronto per duplicare il proprio Dna. Una volta che, tanti nuovi genomi si sono formati, questi fungono da stampo per la formazione di messaggeri tardivi, che portano l’informazione per la sintesi delle proteine strutturali. Una volta che avremmo tanti nuovi genomi e tante nuove proteine strutturali segue l’ultima fase, l’assemblaggio, alla quale seguirà lo scoppio, perché il virus produce lisozima, dell’E.coli, e il Simone Pisu Sezione Appunti Virologia molecolare riversarsi in ambiente extracellulare di una nuova progenie virale. Abbiamo parlato di dimensioni dell'ordine dei nanometri, e sottolineato la peculiarità di un ciclo replicativo durante il quale un virus perde la propria integrità, altra cosa importante è che i virus hanno un genoma costituito o da Dna o da Rna mai entrambe queste molecole presenti contemporaneamente. Cosa significa questo? Noi sappiamo bene che il flusso di informazione genetica va da Dna a Dna, da Dna a Rna, dall'Rna alle proteine, ciò significa: un virus con genoma costituito da Dna, una volta che è all'interno della cellula, può inserirsi tranquillamente in quello che è il normale flusso di informazione della cellula. I virus con genoma costituito da Rna si trovano a dover affrontare un grosso problema per la loro espressione. La cellula ospite, per formare dei messaggeri, utilizza un Rna polimerasi Dna dipendente, un virus che ha un genoma a Rna non può utilizzare questa attività enzimatica. La cellula non gli può venire incontro perché, essendo il flusso dell'informazione Dna-Rna-Proteine, la cellula non utilizza una Rna polimerasi Rna dipendente. Il virus codifica una Rna polimerasi Rna dipendente che, consente al genoma di potersi esprimere. (Quando studiate dovete sempre chiedervi: se il genoma del virus sia a Rna o Dna e quanto Dna o Rna abbia.) I virus a Dna (deossiribo virus) e i virus a Rna (ribovirus) possono avere un genoma a singola catena o a doppia catena. Una classe particolare di virus, i Retrovirus e i virus dell'epatite B, hanno l'informazione genetica contenuta in Dna o Rna ma in diversi momenti del ciclo di replicazione virale. L'esempio classico di retrovirus è l'HIV: il genoma è costituito da un Rna lineare, possiede una particolare attività enzimatica che è la trascrittasi inversa, cosi il genoma a Rna, durante il ciclo di replicazione di questo virus, viene convertito in Dna che poi va a integrarsi nel cromosoma della cellula ospite. Il virus dell'epatite B fa esattamente il contrario: ha un genoma costituito da Dna, nella particella virale completa e infettante ma, nel corso del ciclo replicativo, il virus ha scelto come via evolutiva quella di trasferire la sua informazione dal Dna all'Rna. Dopo aver visto che genoma contiene quel virus andiamo a vedere quanta informazione questo virus contiene. I Dna virus hanno un'informazione che va da 3,2 a 200 Kbp quindi enorme varietà. Gli Rna virus hanno un'informazione che va da 1,7 a 27 Kbp. Perché è importante riflettere sulla quantità di informazione che un virus contiene? Un virus molto piccolo, 20 nm di diametro, ha un'informazione genetica di soltanto 2000 nucleotidi. È un virus che ha un'informazione genetica talmente scarsa che, soltanto sintetizzando due proteine è in grado di terminare la propria replicazione. All'estremo opposto, un virus grande (esempio del mimivirus), circa 500 Simone Pisu Sezione Appunti Virologia molecolare nm di diametro, 1,2 milioni di nucleotidi, ha la possibilità di sintetizzare 1200 proteine. È importante avere questa informazione perché, immediatamente vi dice che le strategie replicative di questo piccolo virus, paragonate rispetto a quello più grande, saranno profondamente, tra loro, differenti. Qui, stiamo analizzando un virus, mi viene in mente il fago MS2 che, per realizzare la propria sintesi è dipendente, in maniera massiva dalla cellula ospite. Questo virus, più ricco di informazione genetica, che scende in campo con molte proteine virali, sarà molto meno dipendente e potrà arrivare, per esempio, ad aumentare il proprio genoma in maniera indipendente dalla cellula ospite. Cosa voglio dire con duplicare in maniera autonoma il proprio genoma? Non soltanto per la sua polimerasi ma per tutte quelle attività enzimatiche che gli servono per duplicare il proprio genoma. Quindi è importante la valutazione della quantità del Dna o Rna, e ricordiamo il problema che devono risolvere gli Rna virus: hanno un template di Rna, entra una molecola di Rna nel citoplasma di una cellula, la cellula non gli offre nessuna Rna polimerasi Rna dipendente, però il virus non ne può fare a meno. Non ne può fare a meno per due motivi: questa attività enzimatica gli serve per copiare l'Rna genomico e fare tanti nuovi Rna genomici, in parole più corrette deve duplicare il proprio genoma, come pure gli è indispensabile per sintetizzare i propri Rna messaggeri. Abbiamo visto come, la stragrande maggioranza dei virus codifica per una propria Rna polimerasi Rna dipendente che è in grado di consentire al virus entrambe queste funzioni: duplicare il proprio genoma e sintetizzare i propri Rna messaggeri indispensabili alla realizzazione di un ciclo replicativo. È importante sapere, all'inizio dello studio di un virus, quantità ecc, anche perché ci da un'idea di quella che è la capacità di questo virus di evolversi. Simone Pisu Sezione Appunti Virologia molecolare Perché abbiamo un diverso ritmo di capacità evolutiva tra gli Rna, che sono rapidissimi e i Dna che ovviamente hanno un ritmo ben inferiore? Dipende, dalla serietà con cui lavorano gli enzimi che sono preposti alla replicazione degli acidi nucleici. I Dna virus duplicano ricorrendo a una Dna polimerasi Dna dipendente. Questa è un'attività enzimatica precisa, che svolge bene il proprio lavoro che addirittura, che se compie un errore, è capace di fermarsi e tornare indietro per correggere. A dispetto di questo è anche vero che, la Dna polimerasi, ogni 10 - 10^11 basi che aggiunge compie un errore. Si ha l'insorgenza di mutazioni e queste mutazioni sono uno degli avvenimenti principali che concorrono al processo evolutivo dei virus. Come funziona una Rna polimerasi Rna dipendente? È priva della possibilità di correggere errori, è un enzima paragonato alla Dna polimerasi che, in maniera più semplicistica possiamo dire che è più arrafazionale(?). Arriva a compiere un errore ogni 10^3 - 10 paia di basi. Ecco che, i virus a Rna, a seguito di questo tasso mutazionale così elevato mutano con estrema velocità (con conseguenze molto importanti per l'ospite). Tenete presente che questa situazione ha delle ripercussioni molto importanti sotto vari aspetti. Anche la trascrittasi inversa, che i retrovirus utilizzano per convertire l'informazione genica da Rna a Dna, che poi viene integrato nel cromosoma ospite, anche questo, come la Rna polimerasi Rna dipendente, è un enzima piuttosto impreciso: ha lo stesso valore per quanto riguarda gli errori durante il funzionamento, un errore ogni 10^3 - 10 basi aggiunte. Il genoma dell'HIV, che nel corso della propria replicazione utilizza una trascrittasi inversa con questo tasso mutazionale, ha un genoma costituito da 10 ribonucleotidi. Ogni volta che la trascrittasi inversa legge, o meglio copia questo genoma a Rna per formare una molecola di Dna, inserisce per lo meno un errore. Se noi pensiamo che in un individuo infetto da HIV, si può arrivare ad avere la produzione di 10^11 particelle di HIV ci rendiamo conto dei mutanti che insorgono in un solo ciclo di replicazione nelle 24 ore. Questo giustifica la difficoltà ad ottenere un vaccino, lo stesso è vero per un farmaco. Non è solo importante per l'insorgenza e per i risvolti di una malattia, il funzionamento delle polimerasi ma: il vaccino antipolio, ne abbiamo a disposizione due, il vaccino di Salk con il virus inattivato e il vaccino di Sabin che è invece un virus attenuato ossia un virus vivo che ha perso il proprio potere patogeno. Quando ad un bambino sano viene somministrato questo vaccino di Sabin abbiamo che il virus attenuato replica nell'intestino di questo bambino, suscita quindi una risposta anticorpale efficace nel proteggere quel bambino quando incontrerà il wild type, ossia il ceppo selvaggio della malattia, però il sistema immunitario di questo bambino è valido e quindi nell'arco di un mese, un mese e mezzo, elimina il principio vaccinante, il virus attenuato ha stabilito una bella immunità e tutto è andato liscio. Cosa succede se questo vaccino viene somministrato ad un bambino molto piccolo che presenta problemi al sistema immunitario con immuno-deficienza? In questo bambino il sistema immunitario non è capace di debellare il virus, il virus attenuato continua a Simone Pisu Sezione Appunti Virologia molecolare replicarsi. Questo cosa comporta? Il Poliovirus è un virus a Rna e affida la propria replicazione ad una Rna polimerasi Rna dipendente estremamente inaccurata, si allunga il periodo di sopravivenza del virus nel bambino vaccinato, aumenta la possibilità che a seguito di errori della polimerasi il ceppo che ha perso la propria virulenza, abbia, per mutazione la probabilità di ritornare ad essere nuovamente virulento. Simone Pisu Sezione Appunti Virologia molecolare 3. Virus e malattie umane I virus sono importanti cause di malattie e qui c’è il riassunto in questa tabella. Possono parassitare tutte le forme di vita, abbiamo l’uomo, animali, funghi, piante, protozoi, batteri, sono tutte cellule che possono fungere da ospiti per la replicazione di un virus. Le infezioni virali nelle piante e animali, soprattutto quelli commestibili, hanno un effetto sull’economia umana, per questo si cerca un farmaco o vaccino. Ma non pensiamo ai virus solo come microrganismi estremamente cattivi in grado di mettere a repentaglio la nostra salute, essi svolgono anche un ruolo importante nell’intero nostro sistema. È stato fatto un calcolo che, i batteriofagi che sono i virus che hanno una morfologia complessa, dotati di coda, raggiungono un numero pari a 10^31, una quantità enorme. Ciascun batteriofago è lungo 200 nm. Se noi prendiamo questo 10^31 batteriofagi e mettiamo in fila, hanno calcolato che copriamo una lunghezza pari a 2 x 10^21 chilometri, è una distanza che poi ci porta alle più lontane galassie. Un’altra considerazione è che circa il 98% della popolazione che vive negli oceani è formata da microbi, ed è all’attività fotosintetica di questi microbi che si deve la formazione di circa il 50% dell’ossigeno che è presente nella nostra atmosfera. È stato calcolato che, i virus presenti negli oceani, distruggono ogni giorno circa il 20% della popolazione microbica. Di conseguenza i virus svolgono un ruolo importante sia nel ciclo del carbonio, sia nel regolare il tasso dell’ossigeno presente nella nostra atmosfera. Quindi hanno un fondamentale ruolo nell’intero nostro Simone Pisu Sezione Appunti Virologia molecolare sistema. Lo studio dei virus ha dato molte informazioni per la biologia molecolare, per esempio con lo studio dei virus si sono scoperti gli oncogeni che svolgono un ruolo fondamentale nel regolare la crescita cellulare e partecipare al differenziamento, individuati i promotori riconosciuti dalle Rna polimerasi nelle cellule procariotiche, scoperti gli enzimi che partecipano alla replicazione del Dna, scoperto il processo di Rna splicing fondamentale nella formazione degli Rna messaggeri. Ogni volta che noi studieremo un virus ci porremmo queste tre domande, che rispondono ai problemi che i virus devono risolvere per potersi replicare. Il primo problema è come riuscire a riprodursi una volta che si trova all’interno di una cellula. Il secondo problema, uno dice un virus infetta, replica fa una progenie virale, però deve essere anche in grado di trasmettersi da un individuo ad un altro per avere aperta la strada che porta alla sua evoluzione. Terzo problema, quando un organismo è infettato da un virus, l’organismo non è che rimane li vittima dell’infezione virale, ha a disposizione un sistema immuno-competente che reagisce all’infezione del virus con l’obbiettivo di controllarla ed eliminarla. I virus però si sono fatti furbi e hanno messo in atto strategie per contrastare le nostre difese naturali. Questo sarà lo schema sul quale imposteremo lo studio di un virus. Il primo problema, vi ripeto, è come riprodursi quando entra in una cellula. Vuole produrre una nuova popolazione virale che poi riversa in ambiente extracellulare. Il virus, allo stato extracellulare, trova dei recettori nella superficie della cellula ospite, per poi poter entrare nella cellula, il virus entra attraverso un processo di endocitosi (la membrana citoplasmatica, per il legame con i recettori, si invagina) e si viene a ritrovare all’interno di una vescicola di fagocitosi nel citoplasma. Comincia il processo di svestizione chiamato uncoating che ha come punto d’arrivo la liberazione dell’acido nucleico. L’acido nucleico virale, a questo punto deve ricorrere all’aiuto, nella cellula vuole compiere un processo di trascrizione per arrivare alla sintesi dei propri messaggeri come pure gli serve un apparato proteino-sintetico per sintetizzare le proteine virus specifiche. Quindi, per i processi di trascrizione e di traduzione, chiede aiuto alla cellula ospite. Una volta che si sono sintetizzati gli enzimi che servono alla loro replicazione ecco che il virus può formare tanti nuovi genomi, che combinandosi con le proteine strutturali vanno ad assemblarsi all’interno della cellula, si formano nuove particelle virali che poi vanno rilasciate in ambiente extracellulare. Vi ho detto (diapositiva 1) che alcuni virus sono nudi e che altri hanno un rivestimento esterno envelope o involucro pericapsidico, questo envelope è acquisito dalla particella virale durante la fuoriuscita dalla cellula ospite. Nella diapositiva 22 si vede che il virus entra per endocitosi, si libera della vescicola endocitica, rimozione del capside ed esposizione dell’acido nucleico. Cosa deve fare? Tante copie, tanti nuovi genomi, tante nuove proteine strutturali. Genomi e proteine strutturali si assemblano, nel processo di maturazione si formano nuove particelle virali che portano alla vestizione della cellula (questo è un virus …. non tutti i virus fanno questo) ed ecco la progenie viene formata e si libera in ambiente extracellulare. Simone Pisu Sezione Appunti Virologia molecolare Siamo al primo problema che il virus deve risolvere, come replicare una volta che è penetrato all’interno di una cellula ospite. Perché la replicazione abbia luogo un virus deve essere in grado di presentare al macchinario proteino-sintetico della cellula, uno o più RNA-messaggeri che la cellula possa riconoscere e tradurre nelle relative proteine. Si arriva così alla sintesi delle proteine virali. Per raggiungere questo obiettivo, un virus deve essere in grado di superare alcuni ostacoli imposti dalla organizzazione della cellula ospite: 1. Nella cellula eucariotica, gli RNA messaggeri vengono sintetizzati nel nucleo, per trascrizione del DNA ad opera della RNA polimerasi-DNA dipendente. Quale virus può infettare una cellula e tranquillamente inserirsi in questa strada? I virus che hanno un Dna però devono saper arrivare nel nucleo, sono i cosiddetti Dna infettanti. Io prendo una particella virale, la spoglio di tutti i rivestimenti, prendo l’acido nucleico e artificialmente lo faccio entrare nella cellula, raggiunge il nucleo che è il punto di partenza per la formazione di nuove particelle virali. Abbiamo il virus del vaiolo a Dna, che ha scelto, pur avendo un genoma a Dna, di replicare nel citoplasma e non può andare nel nucleo. Cosa serve quindi per fare i messaggeri? Una Rna polimerasi Dna dipendente e parte della particella virale. Quando il virus del vaiolo infetta la cellula, in questa cellula entra non soltanto il genoma virale, ma anche l’Rna polimerasi Dna dipendente indispensabile a quel virus che sintetizzerà nel citoplasma i propri Rna messaggeri. Un altro problema è che un virus deve chiedere enzimi in prestito alla cellula per duplicarsi, un apparato proteino sintetico, in particolare, nel caso dei Dna virus cosa gli serve? Serve una Dna polimerasi dna dipendente, delle…., delle …. Chinasi, la cellula gli deve dare tutto questo. La cellula gli può dare tutto ciò quando è in attiva replicazione, se una cellula è …. il virus si trova in difficoltà. Tutte le cellule differenziate hanno cessato di esprimere le attività enzimatiche implicate nella duplicazione del Dna, ecco che i virus hanno risolto questo problema con due modalità diverse. Un esempio è quello di Herpes virus instaurano latenza nelle cellule nervose. Le cellule nervose duplicano il loro Dna? No! Sono cellule altamente differenziate. Quando il virus infetta quella cellula lo fa perché vuole instaurare latenza, vuole rimanere nascosto per sfuggire al sistema immunitario, però ogni tanto quell’Herpes virus si risveglia e ha bisogno di tutto quel corredo enzimatico che provvede alla sintesi di Dna. La cellula nervosa non glielo offre ed ecco che nel genoma dell’Herpes troviamo l’informazione che porterà a tutti quegli enzimi che sono indispensabili al virus a duplicare il proprio genoma. In altre parole, ha l’informazione genetica sufficiente perenne nella propria replicazione, indipendente da quella della cellula. Altri virus, purtroppo per noi, hanno scelto una strada diversa: 2. Replicazione in cellule “resting” Questo Dna virus è in crisi e da un calcio a quella cellula e la costringe a riprendere il suo ritmo replicativo e questi sono i cosiddetti virus oncogeni in grado di trasformare la cellula. Quest’ultima è quiescente e i virus Simone Pisu Sezione Appunti Virologia molecolare danno una spinta alterandone i meccanismi di controllo, ed ecco che quella cellula rientra in fase S e ricomincia a sintetizzare quelle attività enzimatiche indispensabili al virus. Un altro problema serio è che noi stiamo parlando di virus animali, virus che infettano una cellula eucariotica e sappiamo che: 3. Il macchinario proteino-sintetico della cellula eucariotica è predisposto esclusivamente per la traduzione di messaggeri monocistronici. Cosa vuol dire monocistronico? Un messaggero porta l’informazione per un’unica proteina. Quel messaggero ha un unico punto di contatto con il ribosoma e il risultato è un’unica proteina. Diversamente le cellule procariotiche hanno rna policistronici, più punti del messaggero possono prendere contatto con il ribosoma e la conseguenza è che quel messaggero porta l’informazione per più proteine. Quindi il virus deve risolvere questo problema: se sintetizza un rna messaggero che porta l’informazione di più proteine la cellula eucariotica non lo può aiutare. Altro problema molto importante, il virus in qualche maniera riesce a sintetizzare i propri messaggeri, questi messaggeri ovviamente, sono in competizione, a livello dei ribosomi, con una miriade di messaggeri cellulari: 4. Nella cellula infetta l’espressione dei geni virali è in competizione con una miriade di geni cellulari che vengono contemporaneamente trascritti e tradotti. Il virus deve dire ai messaggeri cellulari di andare via, l’apparato proteino sintetico ora serve a lui, perché vuole sintetizzare proteine virali. Gli rna virus, abbiamo detto che, in assenza di una Rna polimerasi Rna dipendente nella cellula, codificano informazione per sintetizzare questa attività enzimatica indispensabile alla loro replicazione. Ecco la classificazione di Baltimore dei virus: Simone Pisu Sezione Appunti Virologia molecolare Abbiamo virus a Dna a singolo e a doppio filamento, virus a Rna a singolo e doppio filamento ed i retrovirus. Il nocciolo è questo: entra un virus in una cellula, il genoma può essere a Dna o Rna, che cosa deve fare questo virus per prima cosa? Vuole tanti nuovi genomi e tante nuove proteine capsidiche, quindi deve sintetizzare gli Rna messaggeri, è il punto di partenza in tutti i casi. Quindi, che tipo di Dna c'è? Quanto Dna c'è? Ha un elevato tasso mutazionale? Quindi, dove si colloca il virus che stiamo studiando nella classificazione di Baltimore. Sono sette classi: • Virus a Dna bicatenario: sono i più fortunati, perché sono capaci di arrivare nel nucleo, hanno a disposizione dalla cellula tutto quello che gli serve per arrivare alla sintesi di un messaggero. Questo Dna bicatenario va nel nucleo, c'è una Dna polimerasi dna dipendente che la cellula gli offre e la utilizza, così molto facilmente arrivano alla sintesi del messaggero. • Virus a Dna a singola catena: deve prima di tutto duplicarsi. Dapprima i virus provvederanno a duplicare il proprio Dna e poi loro arriveranno alla sintesi dei messaggeri. • Virus a Rna a polarità positiva (Rna +): l'esempio è il poliovirus. Con il + si indica che questo rna è già un Rna messaggero, riconosciuto dai ribosomi. Il genoma e il ribosoma hanno lo stesso segno, il polio entra prende contatto con i ribosomi e realizza velocemente la sintesi delle proprie proteine. • Virus a Rna a polarità negativa (Rna -) e virus a Rna a doppia catena: entra un rna che non può fungere da messaggero cioè non è riconosciuto dai ribosomi, e la cellula non gli può dare nulla in prestito. Dovranno avere presente nella particella virale, una Rna polimerasi Rna dipendente. Grazie alla presenza, nella particella virale, di questa attività enzimatica, questo Rna verrà dapprima trascritto (prima sintesi Simone Pisu Sezione Appunti Virologia molecolare macromolecolare). L'rna a polarità negativa verrà copiato per arrivare alla sintesi di un Rna messaggero e arrivati a questo punto si potrà sintetizzare le proprie proteine tranquillamente. La stessa strategia viene utilizzata per l'rna a doppia catena, entra nella cellula e nel citoplasma, grazie all'attività enzimatica che si è portato dietro, potrà essere trascritta la catena di segno meno per arrivare ad un Rna messaggero a polarità positiva. • Retrovirus: è un Rna a polarità positiva, potrebbe fungere direttamente da messaggero ma ha scelto una strada differente. In questo virus è presente una trascrittasi inversa che copia il genoma a Rna a singola elica, trasformando in un intermedio a Dna bicatenario. Una volta che si è formato questo Dna sotto forma di provirus va a integrarsi nel cromosoma della cellula ospite. Rna monocatenario, grazie alla trascrittasi inversa formazione di un Dna bicatenario e sua integrazione nel Dna dell'ospite. Il Dna integrato potrà essere trascritto dalla Rna polimerasi dna dipendente della cellula ospite, per arrivare alla formazione di messaggeri. I virus però non possono limitarsi a infettare solo un individuo, perché con la morte di quell'individuo morirebbe anche il virus. Deve quindi risolvere il problema di trasmettersi da un individuo a un altro. Che strada ha imparato il virus? Ha imparato strade che riflettono quelli che sono normali comportamenti dell'uomo, si trasmettono con una stretta di mano, con un colpo di tosse, con un rapporto sessuale sono queste legate al comportamento che i virus utilizzano per passare da un individuo a un altro. Ma non deve solo trasmettersi da un individuo all'altro, quando arriva in un nuovo individuo deve essere capace di trovare la strada che lo porta alle cellule nelle quali può replicarsi. Non tutte le cellule del nostro organismo sono sensibili ai virus, i virus invece sono altamente specifici nel tipo di cellule all'interno della quale riescono a replicare. Alcuni virus riescono a replicare solo in un tipo di cellule, altri hanno uno spettro più ampio ma è sempre limitato il numero delle cellule all'interno delle quali il virus può realizzare il proprio ciclo replicativo. Il terzo problema è abbastanza serio per i virus, una volta che cominciano l'infezione, il nostro sistema immuno-competente cerca di eliminare questa infezione, il nostro sistema immunitario escogita qualcosa di nuovo per difendersi ed ecco che il virus immediatamente trova il modo di sovrastare questa nuova difesa dell'ospite. Si crea una sorta di bilanciamento, il virus non vuole portare a morte l'ospite e se cosi fosse velocemente l'ospite andrebbe a estinguersi e cosi si abbasserebbe, per il virus, la probabilità di sopravvivere, muore l'ospite e muore anche il virus. Si crea una sorta di battaglia a tutt'oggi aperta, il sistema immunitario fa un passo avanti e il virus cerca di scavalcare. Ricordiamo ancora una volta dell'elevato tasso mutazionale che caratterizza i virus che porta all'insorgenza di nuove varianti, quella che meglio si adatta al particolare ambiente. Per esempio il virus dell'influenza cambia il suo vestito superficiale perché così gli anticorpi sintetizzati l'anno scorso non hanno più alcun effetto così il sistema immunitario deve sintetizzarne di altri. Le malattie che i virus causano sono la conseguenza del modo con cui un virus ha scelto di risolvere i tre problemi della riproduzione, della trasmissione e dell'evasione dall'ospite. Simone Pisu Sezione Appunti Virologia molecolare Questo significa che, una volta che capiamo come un particolare virus risolve questi tre problemi saremmo anche capaci di predire le conseguenze patologiche di quella infezione virale. Perché un virus causa malattia? In molte occasioni è la conseguenza dell'infezione virale, un virus infetta alcune cellule del nostro organismo e le distrugge portandole a morte. In altri casi invece, la malattia virale è la conseguenza di una reazione dell'ospite che è troppo marcata, il sistema immunitario interviene per cercare di arginare l'infezione virale ma una risposta marcata diventa la causa di malattie. Ho suddiviso i virus che vedremmo secondo le modalità di trasmissione in quattro gruppi: • Per via respiratoria: influenza, rhinovirus (del raffreddore), measles (del morbillo). Vedremmo i cicli replicativi e come questi qua si difendono dall’ospite. • Per via alimentare: rotavirus, adenovirus, epatite A. • Per via materno-fetale: epatite B, epatite C, HTLV1 (virus della leucemia cellule T dell’adulto). • Per via sessuale: HIV, herpes simplex, papilloma. Abbiamo concluso la lezione della scorsa settimana esaminando tre problemi che il virus, all'interno della cellula, deve necessariamente risolvere. 1. Il primo problema deve essere in grado di riprodursi in particolare come punto centrale dalla modalità con cui il virus si introduca come rna messaggero. 2. Il secondo problema è che una volta ospitato all'interno di una cellula di un dato organismo, deve essere in grado di trasmettersi da un individuo ad un altro per assicurarsi di proseguire il proprio processo. 3. Terzo problema una volta che un organismo è infettato da un virus non rimane inattivo a subire l'infezione virale ma ha un sistema di difesa chiamato sistema immuno-competente ed ecco che i virus hanno elaborato delle sofisticate misure per contrastare le nostre difese. Proprio perché è cosi importante conoscere come un virus si difende dall'ospite, la lezione di oggi sarà dedicata a una carrellata sulla risposta immunitaria. Sono conoscenze che già avete dal corso di microbiologia generale ma è importante avere chiari, impressi nella mente, quali sono i momenti salienti e determinanti in quella che è la risposta immunitaria nei riguardi dell'infezione virale. Nello svolgimento del corso esamineremo tantissimi virus, le modalità messe a punto da questa classe cosi peculiare per contrastare le difese immunitarie. Le difese dell'ospite sono organizzate in tre strati: una barriera chimica superficiale che ha il compito, essendo in superficie, sarà quella esposta ad un numero maggiore di virus, è una barriera di tipo chimica che può essere con una certa facilità superata. Il secondo strato è quello dell'immunità innata, presente alla nascita in tutti gli animali, ha quattro armi di difesa. Quando il secondo strato viene superato scatta una difesa molto forte che è quello rappresentata dall'immunità adattativa che comprende sia una risposta umorale che una risposta di tipo cellulo-mediata. Potete anche vedere da questa prima diapositiva, questi sono i virus invasori, sicuramente il contagio, ogni Simone Pisu Sezione Appunti Virologia molecolare strato ha una propria efficacia resistente al nostro organismo, il passaggio da uno strato all'altro vedete come decresce il numero dei virus infettanti. Una barriera fisico chimica molto efficace, lo vedremo tra poco, a livello della cute una cute integra dice al virus tu non passi, basta la mia presenza per ostacolare il processo infettivo. Lacerazione della cute scatta immediatamente la risposta innata. Per alcune infezioni virali, come quelle da endovirus è sufficiente nelle maggior parte dei casi una risposta innata senza chiedere aiuto alla risposta adattativa per risolvere l'infezione. Comunque rimane di fondamentale importanza che anche l'immunità innata può non essere sufficiente alla risposta immunitaria, ecco però che abbiamo a nostra disposizione l'immunità adattativa le cui caratteristiche le descriveremo tra poco. Vediamo una carrellata di quelle che sono le barriere fisiche; la cute integra è un ottima difesa perché tutto dipende dalla sua organizzazione negli strati più superficiali sono presenti delle cellule piene di cheratina, sono cellule morte, sapete molto bene che i virus per replicarsi hanno bisogno di cellule vive e la presenza di cellule morte fa si che questa non sia una strada aperta all'infezione virale. Quando la cute viene lesionata o in seguito ad una puntura di insetto i virus possono raggiungere gli strati più interni, i tratti basali, dove cellule vive consentono al virus di replicarsi. Se la pelle è una buona difesa, sarà ancora più facile per i virus realizzare un infezione tramite le mucose, mucose respiratorie sono rivestite da un epitelio cigliare rivestito da muco, ecco che queste ciglia muovendosi, se un virus è penetrato nelle vie respiratorie , rimuovono verso le parti alte delle vie respiratorie dove possono essere eliminate nell'ambiente esterno con un colpo di tosse. È importante anche il rivestimento del muco perchè il virus per iniziare un processo infettivo deve trovare nelle cellule dei recettori e questo muco riveste questi recettori e il virus non può svolgere la prima fase del ciclo replicativo rappresentata dalla fase di attacco tra anti-recettore virale e il recettore che è presente sulle cellule ospite. Sono barriere che il virus riesce a superare, sono molti i virus che riescono a superare questi ostacoli. La mucosa del tratto digestivo cerca di opporsi ad un infezione virale, se il virus penetra nella bocca già nella saliva sono presenti anticorpi antivirali, il bacio ad esempio non è un veicolo di trasmissione del virus dell'HIV perchè nella saliva sono presenti virus delle proteasi che entrano nel ciclo di replicazione dell'HIV e già a livello della bocca il virus viene bloccato della propria (…). Se riescono a superare la bocca arrivano nello stomaco e trovano un ambiente drammatico con succhi gastrici, ph estremamente basso, condizioni che un virus deve essere proprio evoluto per superare queste barriere. Quando il virus arriva nell'intestino trova i succhi pancreatici e sali biliari che attaccano la particella modificandone la propria organizzazione e impedendone l'espressione e il conseguente ciclo replicativo. Queste mucose sono formate da un mono strato di cellule, al contrario la mucosa vaginale che è pluri stratificata le cellule superficiali sono cellule squamose altamente differenziate che hanno cessato di dividersi, ancora una volta una cellula quiescente non è un ambiente ottimale per il virus che ha bisogno di cellule metabolicamente attive ed inoltre questa mucosa per essere porta di ingresso per un virus deve essere lacerata, ma le difese non si limitano all'organizzazione della mucosa, ma sapete che la vagina è colonizzata da lattobacilli che determinano un ph estremamente basso situazione non vantaggiosa per la maggioranza dei virus. Possono essere superate ma il ruolo di queste barriere fisiche è quello di diminuire il numero di virus che penetrano all'interno del nostro Simone Pisu Sezione Appunti Virologia molecolare organismo, penetrare nel nostro organismo vuol dire far scattare immediatamente quella che è la risposta innata. Simone Pisu Sezione Appunti Virologia molecolare 4. La risposta innata ai virus Questa risposta innata ha a disposizione 4 armi, questi sono i fagociti primi fra tutti i macrofagi, il sistema del complemento, l'interferon e le cellule natural killer. Questi sistemi possono scattare e funzionare da soli o se il numero di virus infettanti è molto elevato agire in concerto tra di loro attivandosi le une con le altre. I macrofagi I macrofagi hanno un ruolo determinante nel far scattare la risposta innata; i macrofagi sono delle cellule sentinella localizzate subito al di sotto della mucosa, sono cellule spazzine, possono fagocitare un virus e i detriti che vengono fagocitati entrano formando un fagosoma che si fonde con i lisosomi che sono carichi di enzimi come proteasi, nucleasi che attaccano il microrganismo distruggendolo, il forte metabolismo a livello del fagolisosoma provoca prodotti tossici dell'ossigeno e morte dell'organismo. Se pochi virus infettano il nostro organismo, i macrofagi senza chiedere permesso a nessuno catturano, distruggono e risolvono da soli velocemente l'infezione. Cosa succede se il numero dei virus invasori è molto alto? I macrofagi sono in grado, grazie a citochine, di richiamare altre cellule fagocitarie come monociti circolanti che sono i precursori dei macrofagi e i leucociti polimorfonucleati che costituiscono il 70% dei globuli rossi, richiamati dai macrofagi possono raggiungere il sito di infezione dove i virus hanno superato le barriere fisiche, e svolgere il loro compito di cellule fagocitarie. Un aspetto molto importante dei macrofagi è che tra i fagociti svolgeranno il ruolo di mediatori tra la risposta innata e quella adattativa, fungono da cellule presentanti l'antigene. Come fa un macrofago ad accorgersi che c'è qualcosa di strano nel nostro organismo? I microrganismi hanno nella loro superficie dei profili molecolari associati ai patogeni che caratterizzano un gruppo di microrganismi, un esempio tipico è il lipopolisaccaride che ha una struttura e un profilo di riconoscimento che caratterizzano tutti i gram negativi, lieviti con profilo molecolare associato a un patogeno rappresentato dal zimogeno, acidi teicoici dei gram positivi, particolari strutture presenti sull'envelope di un virus, rna a doppia catena dei ribovirus; quindi delle molecole che caratterizzano non un gruppo di microrganismi dei virus ma sono caratteristiche di un determinato gruppo, proprio utilizzando questi profili molecolari di riconoscimento per esempio come gli acidi teicoici dei batteri gram positivi, lipoproteine dei micobatteri, molecole di rna a doppia catena, sono tutti gruppi molecolari che consentono al fagocita di individuare un particolare gruppo di microbi. Ma come avviene questo riconoscimento? Se i profili molecolari associati al patogeno sono presenti sul patogeno vengono riconosciuti dal fagocita mediante un profilo recettoriale di riconoscimento PRR, quindi da una parte abbiamo una molecola caratteristica sul microbo dall'altra un profilo molecolare di riconoscimento PRR che invece è presente sulla cellula fagocitica. I PRR sono stati isolati per la prima volta nel moscerino della frutta e sono stati chiamati recettori Toll Like. In questa diapositiva vediamo un Simone Pisu Sezione Appunti Virologia molecolare lipopolisaccaride un profilo molecolare associato ai batteri gram negativi che viene riconosciuto dai recettori Toll Like 4, ovviamente di recettori Toll Like ne abbiamo tanti sulla superficie dei macrofagi che gli consentono di constatare i diversi profili molecolari che i microbi possono presentare. Come funzionano le cose? Da prima abbiamo una proteina ( colorata in verde) che si lega al lipopolisaccaride (triangolino rosso), una volta avvenuto questo legame il lipopolisaccaride viene posizionato nella struttura recettoriale CD14 che è sulla superficie del fagocita e quando questo avviene la porzione esterna del recettore Toll Like (nel nostro esempio è il TLR 4 ) subisce un cambio conformazionale. Quindi legando il lipopolisaccaride ad una proteina che lo lega e posiziona in CD14 si hanno ripercussioni sulla conformazione di TLR4 e l'alterata conformazione si ripercuote sulla porzione citoplasmatica del recettore che trasmette questo cambio conformazionale ad una proteina adattatrice. Cosa comporta questo cambio conformazionale nella proteina adattatrice? Comporta l'innescarsi, a cascata, di una trasduzione, di un passaggio di un segnale dalla superficie cellulare al nucleo. In questa via che stiamo esaminando è importante il momento in cui gruppi fosfato vengono trasferiti da una molecola all'altra, quando viene fosforilata questa chinasi IkK. Cosa fa questa fosforilasi IkK quando riceve un gruppo fosforico? Va a fosforilare IkB che è quello che tiene bloccato il fattore di trascrizione NFkB, che quando è legato a questo inibitore è bloccato nel citoplasma. Quando l'inibitore viene fosforilato, NFkB è attivato, può passare nel nucleo ed è un fattore di trascrizione e determina la sintesi di messaggeri dai quali deriveranno tutte quelle proteine che servono alla cellula fagocitaria per essere attivata nei riguardi di un particolare microrganismo invasore. Ricapitolando: arriva un microrganismo caratterizzato da un PAMP (profilo molecolare associato al patogeno), è riconosciuto da un PRR chiamato anche recettore Toll Like presente nel fagocita e il loro incontro innesca, tramite successivi trasferimenti di gruppi fosfato, l'arrivo di un determinato segnale nel nucleo che fa si che vengano sintetizzati quei geni che portano alla sintesi di quelle proteine responsabili dell'attivazione delle cellule fagocitiche. Sistema del complemento Un'altra arma importante dell'immunità innata è rappresentata dal complemento. Quella che scatta è la cosiddetta via alternativa di attivazione del complemento, mentre l'attivazione della via classica fa parte di quella che è l'immunità adattativa per scattare una via classica di attivazione del complemento è necessario che ci sia un complesso antigene anticorpo. Ma perchè si formi un complesso antigene anticorpo ci vuole tempo, ed ecco che viene attivata un altra via, la via alternativa. Il complemento è costituito da più di 20 proteine, alcune delle quali hanno attività enzimatica, le ultime che vengono attivate si depositano sulla superficie del microbo e in alcune situazioni nel caso di un virus si forma questo complesso di attacco alla membrana e verranno fatti fuori più velocemente i virus. Che influenza ha il complemento sulla replicazione virale? Simone Pisu Sezione Appunti Virologia molecolare È una via alternativa, per distinguersi dalla via classica che è innescata dalla formazione del complesso antigene anticorpo. La prima importante proteina in circolo del complemento è la proteina C3; spontaneamente questa proteina è degradata in C3a e in C3b. Il C3b è capace di fissarsi alla superficie di un virus e svolge un ruolo determinante che è quello di opsonizzare, ovvero fa in modo che i fagociti mangino quel virus in maniera molto più verace e più pronta. Per ora siamo solo all'inizio, l'immunità adattativa è ferma. Il C3b inoltre richiama e attiva altri fattori del complemento C5, C6, C7, C8, C9, questi, complessandosi gli uni con gli altri, formano il complesso di attacco alla membrana. Immaginiamo che questo sia l'envelope la membrana del virus al quale si attacca C3, arriva C5, C6 e cosi via fino a che nella membrana si forma un foro, il virus perde la proprio integrità, alla quale si accompagna la perdita della possibilità di attaccarsi alla cellula. Man mano che C3b si fissa al suo virus innesca un maggior clivaggio di C3 in C3a e in C3b, prima avveniva spontaneamente, ma una volta che C3b è legato alla superficie di un virus la scissione aumenta notevolmente. Questo comporta che si formino tante molecole di C3a che non stanno legate alla superficie del virus ma hanno il compito di richiamare cellule fagocitiche, neutrofili, monociti, dal sangue per arrivare ad aiutare i macrofagi stanziali. Siamo a livello di risposta innata, la risposta adattativa è ferma, non si può avere attivazione della via classica però grazie a C3 che spontaneamente si scinde in C3a e C3b, il complemento riesce ad opsonizzare e richiamare altri fagociti grazie al frammento C3a e, grazie all'attivazione a cascata degli ultimi componenti del complemento, a ledere la superficie dei virus dotati di envelope. Queste due armi, macrofagi e complemento, hanno un limite; si accorgono quando c'è un virus invasore mettono in evidenza solo il virus extracellulare, né i macrofagi né il complemento sono in grado di andare a guardare dentro una cellula, dove l'infezione virale è all'interno delle cellule, quindi c'è bisogno di nuove armi che siano capaci di individuare e distruggere le cellule all'interno dei quali un virus si sta replicando. Queste due armi sono rappresentate dal Interferon e dalle cellule Natural Killer (NK). Che cos'è l'interferon? È una proteina, ne conosciamo di 2 tipi: all'interferon di tipo 1 appartengono quello alfa e beta, che sono quelli importanti per l'attività anti-virale, mentre all'interferon di tipo 2 appartiene quello di tipo gamma che ha un ruolo di immuno-modulante. L'interferon è stato scoperto nel 1957 da Lindenmann, fece un esperimento infettando colture cellulari in laboratorio. Aveva visto però che una successiva infezione di queste colture con lo stesso virus o virus diversi, non partiva il secondo ciclo di infezione e la proteina responsabile di questa interferenza virale è stata successivamente identificata con il nome di interferon. E quando si è scoperto che il nostro organismo produceva una sostanza con potere anti-virale si è gridato a grande successo abbiamo a disposizione un farmaco che possiamo utilizzare nella terapia delle infezioni virali. Questo primo entusiasmo è andato scemando, in un primo momento la proteina è stata clonata, prodotta in grandi quantità ma il risultato è stato deludente perchè ha un emivita estremamente breve, è una molecola specie- specifica ossia funziona soltanto nella specie che l'ha prodotto, ma l'aspetto più svantaggioso è che l'interferon è dotato di effetti tossici estremamente pericolosi. Infatti oggi viene usato Simone Pisu Sezione Appunti Virologia molecolare solo per infezioni virali piuttosto gravi come epatite B e C, melanomi o altri tumori. Qual è il punto di partenza per la produzione di interferon e qual è la finalità di questa proteina? Molto schematicamente ci aiuta a capire questa diapositiva, a sinistra abbiamo delle cellule infettate che producono interferon, è una molecola che non dura molto ha un emivita abbastanza breve. Non appena queste cellule infette la producono la riversano all'esterno. Qual è il compito di questa molecola nell'ambiente extracellulare? È quello di andare a contatto con cellule vicine, porta un messaggio alla cellula non infetta dicendole: “la cellula vicino a te è stata infettata tu preparati perchè è molto probabile che tra poco anche tu sarai infettata”. Induce per cui l'espressione di geni che allertano le cellule sane e le tengono pronte a difendersi da una prossima infezione virale. Cosa fa scattare nella cellula infetta la produzione di interferon? È sufficiente in alcuni casi il contatto tra la membrana citoplasmatica della cellula ospite e il virus dotato di envelope perchè vengano attivati i geni responsabili per la sintesi dell'interferon; questo è un caso però poco frequente. Il fattore principale che induce nella cellula infetta la produzione di interferon è rappresentato da un RNA bi-catenario. La cellula ospite non ha RNA bi-catenario quindi questo RNA bi-catenario virale è un PRR, funge da profilo molecolare associato al patogeno che può essere riconosciuto da un PRR cellulare che innesca una serie di fosforilazioni che in ultima analisi portano nel nucleo dei fattori attivati di trascrizione che consentono l'espressione dei geni dell'interferon. Ripeto: la cellula è stata infettata dal virus, il virus produce RNA bi-catenario, ovviamente i virus che avranno un RNA bi-catenario come genoma, come i reovirus, saranno ottimi produttori di interferon, però lo saranno anche gli rna virus a singolo filamento dovranno esprimere per forza una rna polimerasi rna dipendente quindi se hanno un rna + lo dovranno copiare in rna – automaticamente questo comporta la formazione di RNA bi-catenari. Secondo voi DNA virus possono formare RNA bi-catenario? Si! Entrambe le catene fungono da stampo nel processo di trascrizione. RNA bi-catenario è riconosciuto come profilo molecolare associato al patogeno da PRR all'interno di quella cellula ed ecco che scatta una serie di fosforilazioni che attivano la produzione di interferon che va nell'ambiente extracellulare trova nella cellula sana dei recettori vi si lega e parte un messaggio che arriva al nucleo per allertare la cellula a difendersi che sarà attaccata da un virus. La cellula allertata quando sarà infettata blocca la replicazione del virus imboccando una via apoptotica. Ciò è fondamentale perchè argina l'infezione. Vediamo un po' meglio come vanno le cose. Questo è il dna, questo è il sito di inizio riconosciuto dalla rna polimerasi che porta alla sintesi dei messaggeri dell'interferon, a monte troviamo un enhancer e perchè possa dare avvio ad un processo di trascrizione deve legare dei fattori di trascrizione che devono essere Simone Pisu Sezione Appunti Virologia molecolare attivati. Il punto di partenza in quella cellula si è formato un RNA bi-catenario, viene riconosciuto come profilo associato al patogeno, segue una serie di fosforilazioni che attivano tutti questi fattori. L'enhancer è fatto di 4 domini regolatori positivi, per avviare la trascrizione è necessario che al dominio 4 si leghino i fattori ATF-2 e c-JUN sono nella forma non fosforilata nel citoplasma, parte la catena di trasferimento del segnale, comporta la loro fosforilazione e così fosforilati riescono ad occupare il quarto dominio. Fosforilazione anche del fattore di regolazione dell'interferon IRF-3 IRF-7 fosforilati durante la trasmissione del segnale e possono raggiungere il nucleo il terzo e il primo dominio. NFkB è analogo a quanto abbiamo visto nel lipopolisaccaride. È presente nel citoplasma ed è inibito dal legame con l'inibitore IkB, quando l'inibitore viene fosforilato NFkB viene liberato e potrà andare ad occupare il secondo dominio di questo sito di regolazione. Quindi fattori di trascrizione attivati comportano come esito finale il legame della RNA polimerasi e l'inizio della trascrizione del gene dell'interferon. Partecipano anche delle proteine HMG1 che sono delle proteine che completano il funzionamento dell'enhancer. Siamo arrivati a sintetizzare il messaggero dell'interferon, questo messaggero è ricco di AUG ed ha un emivita molto breve, questi messaggeri vengono poi tradotti e l'interferon riversato all'esterno. Vi ricordo l'azione di andare ad allertare le cellule vicine sane che hanno dei recettori particolari per l'interferon, sono Tirosine Kinasi, una di queste è il recettore Jak1 e l'altra è la tirosina kinasi 2 (Tyk2). Quando l'interferon si lega a questi recettori sono tra loro ravvicinati, sono dotati di attività kinasica e l'avvicinamento l'uno con l'altro determina che la porzione citoplasmatica venga fosforilata. Una volta che questi recettori sono fosforilati richiamano dal citoplasma la proteina Stat1 e Stat2 vengono a loro volta fosforilate e questa fosforilazione comporta la loro dimerizzazione, migrano nel nucleo della cellula dove saranno responsabile di stimolare i geni indotti dall'interferon. Sono tantissimi i geni indotti dall'interferon con il fine di proteggere quella cellula, ne nominiamo tre: proteine MX, la 2'-5' oligo di A sintetasi e la ribonucleasi L, la proteino chinasi dipendente da rna a doppia catena. Come svolgono la loro funzione queste proteine che derivano dai geni indotti dall'interferon? Un primo esempio ci viene offerto dalle proteine MX: la cellula è stata avvisata dall'interferon, c'è stata attivazione di particolari geni indotti dall'interferon, ecco che quella cellula ha prodotto proteine MX. Queste proteine proteggono la cellula dall'infezione di alcuni rna virus a polarità negativa come per esempio il virus del morbillo. Quando questi virus infettano la cellula attivata ecco che la cellula ha sintetizzato proteine MX che bloccano l'attività dell'rna polimerasi rna dipendente. I virus con rna a polarità negativa hanno un genoma che non può fungere da messaggero quindi un rna polimerasi rna dipendente deve essere un costituente della proteina virale, è indispensabile al virus per la sintesi del messaggero. Cosa succede se un virus influenzale entra in una cellula dove sono stati espressi geni indotti dall'interferon? Produzione di proteina MX che impedisce alla polimerasi di funzionare e bloccano cosi la replicazione di questi virus. Un altro meccanismo dell'attività anti-virale dell MX nei riguardi dell'influenza è che il virus influenzale pur essendo un virus ad rna replica nel nucleo, cosi le proteine MX impediscono l'arrivo del virus dell'influenza nel nucleo blocco del processo replicativo del virus. Simone Pisu Sezione Appunti Virologia molecolare L'altra proteina indotta dall'interferon sotto forma di proteina inattivata è rappresentata dalla 2'-5' oligo di A sintetasi e una ribonucleasi L entrambi queste proteine vengono prodotte in forma inattiva. Cosa succede che questa cellula cosi allertata viene infettata? Il virus comincia il proprio ciclo replicativo e ancora una volta ha dato origine ad un RNA bi-catenario che è in grado di interagire con la 2'-5' oligo di A sintetasi presente nella cellula nella forma inattiva attivandola e l'attività enzimatica forma dei corti oligonucleotidi nei quali residui di A sono legati con un legame 2'-5', circa 10 residui di A vengono legati in questo modo, una volta formato va a legarsi con la ribonucleasi L, altra proteina inattiva indotta dall'interferon, che quando lega il 2'-5' oligo di A risulta attivata e fa fuori tutti gli rna messaggeri sia cellulari che virali. Ricapitolando: una sintetasi e una ribonucleasi sono prodotte in seguito all'induzione determinata dall'interferon, sono prodotte come forme inattive, arriva il virus su questa cellula avremo produzione di RNA bi-catenario che da prima attiva la sintetasi con la formazione di corti oligomeri di A che prenderanno rapporto con un altra proteina indotta dall'interferon attivandola facendo si che possa svolgere la sua azione di ribonucleasi degraderà gli rna messaggeri sia cellulari che virali. La terza proteina indotta dall'interferon è la proteina PKR è una chinasi K che dipende la sua attivazione da una molecola di RNA bi-catenario. Nella parte alta della diapositiva vedete un classico complesso di pre- iniziazzione del processo di sintesi proteica, sapete che la sub-unità piccola 40S si lega col transfert della metionina, con l'rna messaggero e perchè tutto possa avvenire è necessario il fattore della sintesi proteica eIF-2 legato al GTP, una volta che questo si è assemblato verrà richiamata la sub-unità 60S per dare avvio ad un normale processo di sintesi proteica. Una volta che si è formato il complesso di pre-iniziazzione viene liberato il fattore eIF-2 che è stato defosforilato, il GDP va in circolo per andare a partecipare alla formazione di altri complessi di pre-iniziazzione, prima di fare questo però il GDP deve essere di nuovo fosforilato e questa ri-fosforilazione avviene grazie all'intervento del fattore eIF-2b. Cosa succede se in questa cellula l'interferon ha indotto sottoforma inattiva la produzione della kinasi PKR? La cellula ha espresso i geni che sintetizzano il PKR però inattivo, arriva il virus nella cellula allertata e ancora una volta si avrà formazione di doppia catena di rna farà si che due molecole di PKR legandosi come dimero si fosforilino l'una con l'altra e la kinasi PKR verrà attivata, che a sua volta andrà a fosforilare il fattore eIF-2, eIF-2 verrà sequestrato ad opera della PKR sul fattore eIF-2b quindi blocco della sintesi proteica. La cellula si accorge che qualcosa non sta andando bene e imbocca la via apoptotica morte della cellula ma attraverso una strategia che argina l'infezione virale. Questa rispetto a macrofagi e complemento è un arma che funziona all'interno della cellula bloccandone il processo replicativo. Le cellule natural killer Cellule infette possono essere anche eliminate dall'intervento delle cellule NK. Assomigliano molto ai Simone Pisu Sezione Appunti Virologia molecolare linfociti T che svolgono un ruolo nell'immunità adattativa e per essere attivati hanno bisogno di tempo, al contrario le NK sono sempre pronte a riconoscere le cellule infettate. Hanno due meccanismi di azione. Dobbiamo dire prima cosa sia l'MHC: è una proteina del complesso maggiore di istocompatibilità localizzata nella membrana citoplasmatica di tutte le cellule. È fatta di due catene una ancorata alla membrana citoplasmatica che riflettono la composizione proteica di quella che è la cellula, del catabolismo proteico di quella cellula che produce proteine, le quali vengono rallentate e legate alle proteine MHC 1 ed esposte alla superficie, c'è un disegno che mostra in superficie tutte quelle proteine self prodotte all'interno di quella cellula. Sanno anche presentare anche le proteine virali, il virus va ad infettare quella cellula, le proteine di quel virus saranno fatte a pezzettini legate alle MHC 1 e presentate alla superficie di quella cellula ed è proprio questo che consente alle NK di attaccare in modo selettivo le cellule tumorali risparmiando quelle sane. Come vanno le cose? La NK ha due recettori a disposizione (uno rappresentato in rosso e l'altro in azzurro) il recettore in rosso è in grado di saggiare le MHC che sono presenti sulla superficie di una cellula, se riconosce molte MHC su quella cellula la riconosce come cellula normale la cellula avrà la licenza per proseguire. Nelle cellule virus infette è diverso; quando il virus infetta la cellula porta all'interno proteine MHC, quindi nella cellula infetta mancano le proteine MHC cosi che questa cellula sulla sua superficie presenterà delle proteine che sono legate alla replicazione virale, dette proteine da stress. Quando le NK incontrano queste cellule si rendono conto grazie al recettore rosso che non ci sono MHC e grazie al recettore blu si lega alla proteina da stress e questo determina l'attivazione della NK che produrrà perforine che bucano la membrana citoplasmatica della cellula bersaglio e granzimi che penetrano all'interno di questa cellula e imbocca una via apoptotica. Per quanto riguarda l'immunità innata prima di passare a quella adattativa, è importante sottolineare una cosa: l'immunità adattativa può funzionare, facevo l'esempio del raffreddore, nel giro di 3 /4 l'immunità adattativa ben funzionante ne determina quest'infezione e il sistema immuno adattativo non viene neanche attivato. Molte altre volte la risposta innata non è sufficiente, il numero di virus cresce e c'è bisogno di aiuto da parte dell'immunità adattativa per mettere fine a quell'infezione virale. Che cos'è che dice cellule B e cellule T dovete partecipare alla risoluzione di questa infezione virale? Un ruolo determinante è svolto dall'interferon, se si produce molto interferon vuol dire che la replicazione virale è abbondante e molte cellule infettate producono interferon. Un altro segnale è la presenza di moltissimi detriti derivanti dalla morte cellulare. Prima le quattro armi del sistema innato possono lavorare anche da sole, ci sono pochi virus bastano macrofagi e complemento a risolvere tutto, se si incrementa il numero di virus le quattro armi collaborano per aumentare la forza della risposta. Cosa fanno le NK? Ci sono molti virus, cresce la quantità di interferon prodotto e va ad attivare la NK, le NK vanno a produrre Simone Pisu Sezione Appunti Virologia molecolare interferon gamma che va ad attivare ancora di più i macrofagi perchè il numero di virus sta aumentando. Questo macrofago è anche aiutato dal C3b del complemento, a sua volta il macrofago produce un altra citochina che attiva le NK. Tutti i componenti della risposta innata cooperano tra di loro. Nonostante questo alcune volte l'immunità innata non ce la fa e deve chiamare in causa tutto il sistema immuno-competente. Chi è che richiama in causa il sistema immuno-competente? Sono le cellule dendritiche, si spostano dal sito di infezione e liberano nel linfonodo più vicino dove presentano l'antigene alle cellule T. non si limitano a presentare l'antigene ma danno tante altre informazioni sul luogo e tipo di infezione che è in atto. Per queste caratteristiche le cellule dendritiche sono divenute le principali cellule presentanti l'antigene. Le cellule della risposta adattativa hanno tutte origine da una cellula staminale localizzata nel midollo osseo. Avrete esaminato questa diapositiva più di una volta, precursori mieloidi che daranno origine a cellule dendritiche e macrofagi e il precursore linfoide da cui si origineranno le cellule B e T, le cellule B evolveranno in plasmacellule che sono che sono le cellule responsabili della produzione di anticorpi e raggiungono la piena maturazione nel midollo osseo, mentre le cellule T la raggiungono a livello del timo dove si formano i loro recettori di superficie. La cellula B deve sintetizzare un proprio recettore che è ancorato alla membrana citoplasmatica di questo recettore b. per sintetizzare questo recettore la cellula B deve sintetizzare una catena pesante e una catena leggera e combinarle sottoforma di dimero per esporle come recettore alla sua superficie. Di questi recettori ne conosciamo migliaia di migliaia diversi in grado di riconoscere l'enorme popolazione di antigeni. Come si crea questa variabilità? Supponiamo che questi siano i geni della catena pesante, la sintesi di questa catena è fatta arrivando un rna messaggero che è costruito a partire da dei moduli. Abbiamo 4 moduli due dei quali sono i principali siglati con V, I, J, C. Cosa succede in quella cellula quando vuole sintetizzare una catena pesante? Di segmenti genetici V ne ha a disposizione circa 200, ne sceglie uno, di moduli I ne ha a disposizione una 50, ne sceglie un altro in modo che ne abbia a disposizione quattro, scegli uno di questi possibili moduli e li lega insieme. Si genera già in partenza una variabilità enorme. Quando queste sequenze geniche vengono impacchettate tra loro, si assiste a inserzioni o delezioni, aumento della variabilità, ha catturato anche un segmento dal modulo C che forma la porzione costante della catena pesante e il risultato è la sintesi di una catena pesante. Una scelta modulare consente di avere a disposizione tanti geni, fa una scelta gli assembla e questo crea un enorme variabilità. La stessa cosa viene fatta per sintetizzare la catena leggera del recettore. La porzione rossa della catena pesante e della catena leggera si combinano per formare un sito di legame. Ogni recettore che cosi si forma è in grado di legarsi soltanto ad un antigene. Si formano tanti linfociti B superficiali gli uni diversi dagli altri per riconoscere un gran numero di differenti antigeni. Qui abbiamo tre linfociti B uno riconosce l'antigene triangolino, un altro l'antigene stellina e l'altro l'antigene puntino, ecco che arriva l'antigene stellina sarà riconosciuto ovviamente soltanto da questo linfocita B che presenta recettore stellina alla sua superficie, avviene un contatto e questa cellula B comincia Simone Pisu Sezione Appunti Virologia molecolare a crescere e replicarsi formando un clone, questo processo va avanti per una settimana fino a che questa cellula che si è evoluta in plasmacellula comincia a secernere antibiotici che sono identici al recettore presente sulla cellula manca solo quella porzione che legava il recettore alla membrana citoplasmatica della cellula B. Per poter differenziarsi in plasmacellula e produrre anticorpi questa cellula deve ricevere l'aiuto da parte delle cellule Th2. Sapete come è fatta un immunoglobulina? IgG è fatta di due catene una pesante e una leggera, le porzioni variabili delle due catene si combinano insieme per formare un sito di legame per l'antigene, avendo due braccia avrà la possibilità di legare due antigeni in questa figura rappresentata da due triangolini marroni. Sono le globuline più importanti a difenderci a livello ematico. Un altra classe di anticorpi, che sono quelli prodotti per primi nel corso dell'infezione, è rappresentata da IgM: sono composti da 5 molecole di immunoglobulina hanno quindi dieci mani a disposizione per legare l'antigene, sono delle molecole avide ma pur essendo avide non interagiscono in maniera molto marcata con l'antigene e quindi sono avide ma poco affini. IgM sono gli anticorpi che attivano maggiormente la via alternativa del complemento. In questo caso si forma un complesso antigene anticorpo, nella porzione costante dell IgM si lega il primo componente C1 del complemento e parte la reazione a cascata, il risultato sarà opsonizzazione o distruzione delle cellule nel caso si tratti di un virus dotato di envelope. È anche in grado di neutralizzare il virus ovvero gli anticorpi specifici si legano all'anti-recettore virale e bloccano il suo legame al recettore presente sulla cellula. La seconda classe è rappresentata dalle IgG, dopo un certo periodo si ha una commutazione di classe dalle IgM si passa alle IgG o alle IgA a seconda di dove l'anticorpo deve funzionare. Le IgG sono quelle maggiormente prodotte in seguito all'infezione virale a livello ematico, sono quelle che offrono la migliore difesa a livello ematico contro le infezioni virali. Perchè sono cosi forti? Innanzitutto anche loro attivano il complemento, hanno capacità opsonizzante, hanno la capacità di riconoscere proteine su una cellula infetta, ovvero quando il virus cresce all'interno di una cellula modifica, inserendo proteine virus specifiche, la membrana citoplasmatica di quella cellula, una IgG si lega a una proteina virale e fa da ponte tra una cellula infettata e la cellula fagocitica. Molto importante è che le IgG passano dalla madre al feto trasmettendogli l'immunità passiva che è indispensabile al neonato per fronteggiare, quando ancora è privo di un sistema immuno competente, le prime infezioni alle quali va incontro. Le immunoglobuline principali a livello respiratorio, delle mucose dell'intestino, sono le IgA: è un dimero, e la formazione di questo dimero consente a queste proteine di resistere ai succhi gastrici e hanno la capacità di transitare nell'intestino. IgA principale difesa a livello delle mucose. Chi attaccano gli anticorpi? Simone Pisu Sezione Appunti Virologia molecolare Virus alla stato extracellulare, riconoscono antigeni extracellulari. Un grosso pericolo è rappresentato dalle cellule infettate all'interno delle quali si producono un numero notevole di virus. Il sistema immuno-competente deve avere a livello della risposta adattativa un'arma importante per riconoscere le cellule infette, quest'arma è rappresentata dai linfociti T citotossici. Tutte la cellule T non ancora differenziate sono caratterizzate da un recettore, recettore dei linfociti T; il suo ruolo è quello di riconoscere un antigene presentato da una proteina MHC. Le proteine MHC sono di 2 classi: classe 1: sono presenti in tutte le cellule del nostro organismo classe 2: sono soltanto presenti nelle cellule che presentano l'antigene, macrofagi, cellule dendritiche e linfociti T. Cosa succede? Questa è una cellula normale e questa è una cellula presentante l'antigene. Questa cellula normale è stata infettata da un virus, il virus sintetizza le proteine estranee che nel citoplasma a livello dei proteosomi vengono rotte in corti polipeptidi antigenici che nel reticolo endoplasmatico sono legati ad una molecola di MHC 1 e successivamente l'MHC 1 con l'antigene viene esposto alla superficie della cellula e l'antigene cosi presentato viene riconosciuto dalla cellule T citotossiche. Le cellule T citotossiche con il loro recettore TCR si legano a quell'antigene e il legame tra cellula infettata e T citotossico è incrementato dal recettore CD8 presente nelle cellule T citotossiche. La cellula T a questo punto induce l'apoptosi di quella cellula infettata e lo fa rilasciando rilasciando perforine e granzimi. Cosa succede se l'antigene si forma all'interno di una cellula presentante l'antigene? Abbiamo l'esempio di una proteina estranea che arriva, viene fagocitata, si forma un fagolisosoma dove l'antigene viene processato. Nel fagolisosoma arrivano anche MHC 2 che portano legata una catena invariante che viene poi eliminata e l' MHC 2 può essere caricata dell'antigene. Il tutto ancora una volta viene presentato alla superficie della cellula e riconosciuto dai TCR presenti nelle cellule Th. Le MHC sono presenti sulle cellule in grado di presentare l'antigene cellule T, cellule dendritiche, macrofagi. L'MHC 2 sono riconosciute dai linfociti Th che fanno due cose fondamentali perchè sono capaci di differenziarsi in Th1 e Th2. Questa è una cellula presentante l'antigene, un macrofago, ha presentato l'antigene alla cellula Th1 che risponde rilasciando citochine che attivano il macrofago rendendolo capace di una molto maggiore distruzione. Prima di questa attivazione, legata al contatto con la Th1, alcuni microrganismi se ingeriti dal macrofago resistono, non vengono distrutti, ma soltanto dopo queste citochine rilasciate dai Th1 attivano questo macrofago che ne aumenta in maniera notevole la funzione fagocitaria portando a distruggere il microrganismo. Quindi molto importanti per innescare una risposta infiammatoria. La cellula B ha incontrato l'antigene specifico, lo fagocita ma non diventa subito una plasmacellula, ha bisogno della cellula Th2 che rilascia importanti interleuchine 4,5 così che quella cellula potrà evolversi in plasmacellula che produce anticorpi responsabile della memoria immunitaria. Il nostro sistema immuno-competente, grazie alle cellule dendritiche che sono le cellule che trasmettono le Simone Pisu Sezione Appunti Virologia molecolare informazioni sul tipo e luogo di infezione in atto, arrivano ai linfonodi e comunicano alle cellule Th quale fattore far scendere in campo, mettono in atto la miglior risposta immunitaria. Simone Pisu Sezione Appunti Virologia molecolare 5. Il virus dell'influenza È il primo dei virus trasmessi per via respiratoria che considereremo e partiamo proprio dall'analisi di questa via di ingresso di questi virus è una via di ingresso che se ci ragionate un momento è molto facile capire che se diciamo con adeguate misure è possibile impedire la trasmissione dei virus trasmessi con gli insetti utilizzando degli insetticidi, se la monogamia può essere un valido aiuto per ostacolare la trasmissione dei virus trasmessi per via sessuale o una accurata igiene degli alimenti può impedire l'ingresso di un virus di acqua è difficile invece arrestare la circolazione di un virus respiratorio. In una sala di un cinema affollato, sopra un pullman se qualcuno tossisce è estremamente difficile l'unica arma a nostra disposizione sarebbe quella di arrestare il respiro. C'è una certa difesa l'abbiamo nominata la scorsa volta parlando delle vie respiratorie quindi il muco che ricopre le mucose in questo distretto anatomico, ma molto spesso, come nel caso dell'influenza, la particella emessa con la tosse veicola i virus, contiene milioni e milioni di particelle virali, ecco che alcune sì possono essere bloccate dal muco che impedisce l'arrivo della particella virale al recettore presente nella cellula ospite, un piccolo numero sufficiente però a far partire l'infezione riesce a superare questa barriera naturale di difesa per raggiungere la cellula ospite. Perché la scelta di questi tre virus respiratori? Perché diciamo che sono degli ottimi esempi per vedere come tre virus, pur tutti e tre trasmessi per via respiratoria, risolvono con delle profonde diversità i problemi che un virus deve risolvere: 1. essere fondamentalmente in grado di riprodursi, 2. essere in grado di trasmettersi, 3. essere in grado di superare quelle che sono le difese dell'ospite. Com'è fatta una particella di virus influenzale Questa prima diapositiva molto schematicamente ci fa vedere come è fatta una particella di virus influenzale: una particella dotata di envelope questo cerchio grigio che vedete in questa figura, alla sua superficie sono presenti due glicoproteine queste sono l'emoagglutinina e la neuroaminidasi, all'interno dell'envelope queste sferette grigie rappresentano la proteina di matrice e all'interno sono contenuti 8 neurocapsidi; una caratteristica di questo virus a RNA è quello di avere un genoma frammentato in 8 pezzi; si tratta di un genoma a polarità negativa che una volta che è penetrato nel citoplasma della cellula ospite quindi non può prendere un contatto diretto con i ribosomi, deve necessariamente portarsi dietro una RNA polimerasi RNA dipendente che consentirà al genoma di essere copiato quindi convertito da polarità negativa a polarità positiva quindi si forma un messaggero e il virus potrà avviare così la propria sintesi proteica. Quindi quando una cellula viene infettata dal virus influenzale qual è la prima sintesi macromolecolare virus specifica che si manifesta? Simone Pisu Sezione Appunti Virologia molecolare Sarà un processo di trascrizione che utilizza una RNA polimerasi RNA dipendente che come dice il nome utilizza come stampo una molecola di RNA in questo caso l'RNA genomico. Se noi andiamo a vedere più nei dettagli come è fatta una particella del virus influenzale vediamo che alla sua superficie sono presenti ben 600 spicole di queste 500 sono rappresentate dall'emoagglutinina che costituisce l'antirecettore ossia la struttura responsabile del legame del virus alla cellula ospite, le cellule ospiti sono rappresentate dalle cellule dell'epitelio respiratorio e il recettore presente nella cellula ospite è rappresentato da una molecola di acido sialico. 500 spicole di emoagglutinina tra poco le vedremo nei dettagli la struttura e la modalità del funzionamento ed in numero inferiore, sono circa un centinaio le molecole di neuroaminidasi, neuroaminidasi è la seconda glicoproteina che troviamo inserita nell'envelope del virus dell'influenza. Questa neuroaminidasi vedremo svolgere, se l'emoagglutinina comincia all'inizio di un ciclo di replicazione, la neuroaminidasi svolge invece la sua funzione all'estremo opposto quando il virus sta gemmando dalla cellula nella quale si è formato. Subito al di sotto sempre a livello dell'envelope è presente una piccola proteina è la proteina M2 che forma un canale ionico, questo canale ionico svolge un ruolo determinante quando il virus dell'influenza una volta entrato nella cellula in un processo di endocitosi per completare il proprio uncoating. Quindi abbiamo detto emoagglutinina, neuroaminidasi e proteina M2 che forma un piccolo canale ionico importante nel momento dell'uncoating. Subito all'interno del peplos è presente la proteina M1 che è la proteina di matrice più internamente come vi stavo dicendo 8 nucleocapsidi; guardate un attimo questa figura ciascuno di questi 8 nucleocapsidi è legato ad una RNA polimerasi RNA dipendente indispensabile perché questi segmenti genomici possano esprimersi. Ciascun genoma è ricoperto da una proteina nucleo capsidica che avvolge gli 8 segmenti di RNA con una simmetria elicoidale, una cosa importante che non vi ho detto è che la RNA polimerasi ogni segmento di genoma ne porta legata 1 copia e risulta formata da tre proteine, queste sono le proteine PA, PB1, PB2 . Inoltre, in poche copie all'interno della particella virale, è presente la proteina NS2 che vedremo essere importante nel ciclo replicativo virale, quando i nucleocapsidi neoformati devono lasciare il nucleo, è importante tener presente questo: la maggior parte dei virus a RNA ha la capacità di replicare nel citoplasma, il virus dell'influenza fa eccezione, è un virus che nonostante contenga un genoma ad RNA ha scelto di replicare nel nucleo, giustificheremo questa scelta fra poco, vi anticipo che questo dipende perché fondamentalmente ha bisogno di ricorrere a un processo di splicing, ovviamente tutto quello che serve per il processo di splicing nel citoplasma non lo troviamo e quindi questo è un primo motivo per cui il virus deve necessariamente raggiungere il nucleo per potersi replicare, altro motivo è che l'RNA polimerasi RNA dipendente presente nella particella virale non è pronta a trascrivere il genoma per formare i messaggeri ha bisogno di un innesco, per trovare questo innesco deve recarsi nel nucleo, quindi caccia dell'innesco e visto che ha necessita di ricorrere allo splicing per ottenere, per completare il proprio corredo proteico, di conseguenza è un virus che replica nel nucleo. Se io vi chiedessi una domanda forse un po' difficilina: perché questo virus ha scelto di avere un genoma costituito da 8 pezzi??? Secondo voi se tutta l'informazione contenuta in questi 8 pezzi fosse legata in un unico pezzo riuscirebbe il virus a esprimersi in una cellula eucariotica??? Simone Pisu Sezione Appunti Virologia molecolare Mi sembra di avervelo anche già detto, unica informazione trascrive, perché ha l'enzima suo, questa lunga informazione di RNA a polarità negativa; lui ha l'enzima se la trascrive e forma un RNA messaggero, potrebbe questo RNA messaggero andare tranquillamente nei ribosomi e sintetizzare la proteina??? La risposta è proprio qua il ribosoma non riconosce un messaggero policistronico forse riuscirebbe a iniziare a tradurre questa proteina ne vedremo uno la prossima settimana, il rinovirus utilizza proprio questa strategia, in questo caso cosa si è pensato? taglio a pezzi e ognuno di questi 8 segmenti darà origine ad una proteina, questi segmenti l'importante è la quantità, che contenuto di informazione genetica hanno? Andiamo grosso modo da 940 a 2400 ribonucleotidi ognuno di questi segmenti è in grado di sintetizzare per lo meno una proteina, quindi abbiamo 8 proteine garantite. In realtà i segmenti 7 ed 8 proprio perché sottostanno a splicing danno origine a due differenti messaggeri, quindi in totale abbiamo 10 proteine. In una recente scoperta, che è importante perché aiuta a capire qual è il meccanismo di patogenicità del virus dell'influenza che è il segmento che codifica per la subunità PB1 della RNA polimerasi quando è letto secondo un diverso modulo da origine in alcuni sierotipi ad un'altra proteina, quindi alcune specie saranno in grado di sintetizzare 11 differenti proteine. Ricapitolando 8 segmenti ognuno da 1 proteina siamo già a 8 proteine, i segmenti 7 e 8 per splicing ne danno 2, quindi siamo a 10 proteine , il segmento PB1 può essere letto con due diversi moduli di lettura che danno origine a due differenti proteine di conseguenza il totale del numero delle proteine sintetizzate in alcuni sierotipi di influenza arriva a 11. Facciamo adesso una carrellata, abbiamo visto dove sono localizzati i vari componenti di questa particella virale, questa diapositiva riassume quanto vi ho detto sino adesso 8 filamenti di RNA a polarità negativa di lunghezza da 890 a 2441 nucleotidi vediamo che i segmenti 1, 3, 4, 5, 6 una volta che vengono trascritti e tradotti danno origine ad un'unica proteina, il segmento 2 che è il segmento PB1 da origine a due differenti proteine e il segmento 7 ed 8 danno origine in seguito a splicing a due proteine. Esaminando questo splicing ci consente di capire quanto i virus sono intelligenti. Dal segmento 7 dopo splicing si formano la proteina M1 che è la proteina di matrice e la proteina M2 che forma quei canali ionici che abbiamo visto essere rilocalizzati nell'envelope. Gli serve ovviamente molta più proteina di matrice che deve localizzarsi al di sotto dell'envelope, mentre di proteine M2 gli servono molte meno copie, cosa ha pensato il virus?? Fa una scelta di quantità, di M1 me ne serve molto di più che non di proteina M2 che serve per fare pochi canali ionici da piazzare nel mio envelope; com'è che organizza questo?? C'è una ratio dello splicing, ossia ogni 10 molecole di RNA del segmento 7, 9 non subiscono splicing e tradotte danno origine alla proteina di matrice, mentre una sola che subisce splicing darà origine anche alla proteina M2. La stessa cosa riguarda lo splicing del segmento 8, NS1 è una proteina veramente molto importante che svolge soprattutto la funzione di difendere la particella virale da quello che è l'attacco del sistema immunocompetente. La proteina NS2 svolge invece il ruolo, quando il virus si è replicato nel nucleo, i nucleocapsidi devono tornare nel citoplasma e questo è il ruolo svolto dalla NS2 gli serve una maggior quantità di NS2 rispetto a NS1 ed ecco che anche in questo caso il rapporto tra gli RNA messaggeri che non subiscono splicing e quelli che invece lo subiscono anche in questo caso è un rapporto di 9 a 1. Con questa semplice accortezza il virus riesce a fare una scelta quantitativa sintetizzando ciò che gli è più utile. In questa diapositiva in maniera estremamente schematica poi torneremo nei dettagli passo dopo passo vediamo come si realizza il ciclo Simone Pisu Sezione Appunti Virologia molecolare replicativo del virus influenzale. Come replica il virus dell'influenza Il punto di partenza è l'attacco dell'emoagglutinina all'acido sialico che è presente nelle cellule dell'epitelio respiratorio, una volta che è avvenuto l'attacco il virus entra nella cellula la membrana citoplasmatica della cellula ospite si introflette per poi staccarsi all'interno della cellula e si forma un endosoma. Fondamentale perchè il processo possa andare avanti è che il Ph all'interno di questo endosoma scenda, questo attiva il potere fusogeno dell'emoagglutinina e i nucleocapsidi contenuti nella particella virale possono liberarsi nel citoplasma. Vi ho già detto che ha bisogno di procurarsi un innesco per la propria RNA polimerasi come pure abbiamo appena finito di dire che alcuni suoi messaggeri devono sottostare ad un processo di splicing ecco che per forza deve andare nel nucleo, che cosa avviene nel nucleo?? Lo vediamo meglio in questa diapositiva: attacco, endocitosi, abbassamento del pH va nel nucleo l'RNA a polarità negativa grazie all'RNA polimerasi RNA dipendente che è entrata nel nucleo insieme ai nucleocapsidi viene copiato in molecole a polarità positiva; alcune di queste molecole a polarità positiva sono RNA messaggeri altri saranno da stampo per la formazione di genomi negativi per la progenie virale. Una volta che i messaggeri sono stati tradotti e il virus ha sintetizzato tutte le proteine necessarie al suo ciclo replicativo ecco che le glicoproteine emoagglutinina, neuroaminidasi e la proteina M2 vengono piazzate nella membrana citoplasmatica della cellula ospite, il virus riesce in questo punto ad uscire dalla cellula per gemmazione rivestendosi di queste glicoproteine e si libera così nell'ambiente extracellulare, questa è solo una panoramica adesso esamineremo più nei dettagli passo dopo passo come il virus realizza questo processo replicativo. Segue una serie di diapositive con cui presentiamo tutti i componenti che partecipano al ciclo replicativo del virus dell'influenza, la glicoproteina di superficie maggiormente rappresentata dal virus dell'influenza abbiamo già visto essere l'emoagglutinina, sono in questo disegno questi coni gialli e svolge il ruolo fondamentale di essere l'antirecettore, è la porzione della particella virale che si lega all'acido sialico presente nelle cellule dell'epitelio respiratorio ma non ha soltanto questa funzione è anche la glicoproteina che è dotata di potere fusogeno e consentirà di realizzarsi il potere dell'uncoating del virus dell'influenza. Come vedremo svolge un ruolo determinante come antigene ed è anche molto importante per capire l'andamento epidemiologico del virus dell'influenza e si può manifestare sia sotto forma di epidemie sia sotto forma di pandemia. La seconda glicoproteina presente è la neuroaminidasi cinque volte meno presente nell'emoagglutinina la funzione fondamentale della neuroaminidasi, sono questi bastoncini verdi con una estremità allargata rossa, è quella di favorire al virus, una volta che sta avvenendo la gemmazione del virus dalla cellula ospite, di consentirne la liberazione in ambiente extracellulare. La funzione della proteina M2 è quella di formare ve l'ho già detto un canalicolo essenziale per l'uncoating ma vedremo che questa proteina svolge un ruolo importante anche nel momento di maturazione di nuove particelle virali. Abbiamo poi la proteina di matrice e questa figura ci serve per osservare una cosa: la proteina di matrice localizzata al di sotto dell'envelope vedete chiaramente come sono a questa proteina di matrice ancorati gli 8 nucleocapsidi Simone Pisu Sezione Appunti Virologia molecolare che legati insieme costituiscono il genoma del virus influenzale. Abbiamo poi la proteina nucleocapsidica che come vi ho detto riveste con simmetria elicoidale i singoli pezzi del genoma del virus influenzale, un ruolo importante è che regola il meccanismo di funzionamento dell'RNA polimerasi RNA dipendente, cosa voglio dire con questo?? L'RNA polimerasi RNA dipendente un minuto fa vi ho detto necessita di un innesco e questo è il motivo per cui il virus va nel nucleo, però in un momento successivo deve essere anche capace di funzionare senza innesco, quindi ha una doppia attività funzionale, necessita di un innesco però in un determinato momento del ciclo replicativo è in grado di trascrivere anche senza un innesco. Chi è che regola questo passaggio?? È regolato lo vedremo tra poco dalla quantità di proteina nucleocapsidica, altra proteina fondamentale è proprio questa RNA polimerasi che come abbiamo visto è costituita da tre subunità: la subunità PA, la subunità PB1 e la PB2. Cosa fa la subunità PA non è stato ancora palesato, il ruolo che svolga non è conosciuto; il ruolo della PB1 è quello di consentire l'ottenimento di un cap come pure è la porzione della polimerasi che è dotata di attività polimerasica ossia è quella che scorrendo lungo lo stampo sintetizza nuove catene di RNA. La terza subunità PB2 è quella che si lega alla porzione dell'RNA messaggero cellulare da cui il virus ricaverà il proprio cap. Stiamo per finire questa carrellata , ci sono altre due proteine siglate come NS1 e NS2, cosa vuol dire NS??? vuol dire nucleo strutturali, proteine che troviamo all'interno di una cellula quando il virus sta replicando ma non entrano a far parte della proteina completa virale infettante che si libera da una cellula ospite. Recentemente sono molte le nuove conoscenze che riguardano l'NS2 e che in realtà poche copie sono presenti all'interno di una particella di virus infettante tanto è vero che è stata nominata con la nuova sigla NEP che vuol dire proteina di esportazione nucleare; infatti la funzione di questa proteina è quella, una volta che sono stati neosintetizzati nel nucleo i nucleocapsidi, di portarli nel citoplasma da dove poi potranno gemmare formando nuovi virus. Per quanto riguarda l'NS1, proteina fondamentale perché contrasta le difese dell'ospite, però è anche importante perché è la proteina che aiuta il virus a far fuori gli RNA messaggeri cellulari per non avere concorrenti a livello dei ribosomi. Qui abbiamo una banalissima animazione : il virus entra dopo che si è legato ai recettori di acido sialico, c'è un processo di endocitosi, in questa particella di endocitosi l'emoagglutinina acquista potere fusogeno permettendo l' uncoating. In questa animazione vediamo che è un uncoating completo, vedete come il virus si spoglia di tutte quelle che sono le proteine capsidiche e nel citoplasma si libera un genoma, questo non avviene ovviamente nel caso dell'influenza, i nucleocapsidi appena liberati dopo che si ha fusione e liberazione nel citoplasma vanno interi nel nucleo dove entrano attraverso un poro nucleare. Entriamo adesso nei dettagli, l'emoagglutinina (vi ripeto ancora una volta) è quella glicoproteina di superficie responsabile dell'attacco e anche di consentire l'uncoating del virus dell'influenza, risulta presente sotto forma di trimero alla superficie dell'envelope e diciamo ciascuno di questi tre polipeptidi insieme costituiscono il recettore. Appena sintetizzata l'emoagglutinina consiste di un unico polipeptide, questo unico polipeptide neosintetizzato viene localizzato nella membrana citoplasmatica cellulare il virus poi se la porterà dietro nel processo di gemmazione e per poter acquisire il potere fusogeno deve essere clivata in due parti, chi è che cliva l'emoagglutinina nelle due porzioni HA1 e HA2??? Sono delle proteasi che troviamo Simone Pisu Sezione Appunti Virologia molecolare nell'epitelio delle vie respiratorie, cosa succede quando questa proteina viene clivata?? Viene clivata nelle due porzioni dicevo HA1 che contiene il dominio dell'antirecettore ossia è quella porzione dell'emoagglutinina che è in grado di riconoscere l'acido sialico. La porzione invece HA2 che è inserita, prima c'è una porzione idrofobica e con una corta coda viene inserita nel citoplasma stiamo esaminando la sua estremità C mentre all'estremità N terminale è presente la porzione cosiddetta del peptide fusogeno. Unico polipeptide viene clivato in due, una prima porzione HA1 in questa porzione è localizzato l'antirecettore, la porzione HA2 invece troviamo il peptide responsabile invece della fusione. Questo peptide responsabile della fusione rimane nascosto in una porzione idrofobica dell'emoagglutinina e soltanto all'interno di un endosoma, dopo essere avvenuto l'attacco, il virus per endocitosi è stato portato all'interno della cellula, ecco che questo peptide fusogeno può essere esposto, le due porzioni dell'emoagglutinina HA1 e HA2 sono tenute insieme tra loro da un ponte disolfuro. Cosa succede alla fase di uncoating? Attacco, formazione della vescicola endocitotica e il virus deve andare avanti perché deve liberare i propri nucleocapsidi nel citoplasma della cellula infetta, questa è la situazione questa che vedete qua è la membrana dell'endosoma all'interno della quale è presente il virus dell'influenza e alla superficie della membrana dell'endosoma è presente una pompa protonica, qual è il compito di questa pompa protonica?? Portare all'interno dell'endosoma degli ioni idrogeno, cosa comporta l'ingresso di idrogenioni?? ovviamente un abbassamento del pH ed è proprio a seguito di questo abbassamento del pH che si ha esposizione del peptide fusogeno, che ha subito un cambio conformazionale a seguito dell'abbassamento del pH, è in grado di fissarsi su una membrana dell'endosoma avvicina la membrana dell'endosoma al peplos virale realizzando così la loro fusione e a questo punto c'è un momento deve intervenire qualche altra cosa per consentire agli 8 segmenti agli 8 nucleocapsidi di passare nel citoplasma. Siamo arrivati che grazie all'abbassamento del pH l'emoagglutinina ha cambiato la conformazione e questo ha consentito alle due membrane di fondersi una con l'altra. Però gli 8 segmenti, gli 8 nucleocapsidi sono legati alla matrice, non è facile distaccarli, ecco che interviene la proteina M2 che forma quei canalicoli che sono localizzati nell'envelope del virus, c'è una pompa protonica che fa entrare idrogenioni ecco che questi idrogenioni attraverso il canalicolo formato dall'M2 riescono a penetrare all'interno della cellula. Questo abbassamento all'interno della particella virale diminuisce il legame tra matrice e i nucleocapsidi che possono finalmente arrivare nel citoplasma per poi dirigersi nel nucleo. Quindi sia l'intervento della emoagglutinina che l'intervento della proteina M2 è fondamentale per arrivare alla completa liberazione del virus dal suo envelope. Abbiamo sottolineato all'inizio di questa lezione come pur essendo un virus a RNA deve raggiungere il nucleo perché gli serve un cap e perché deve andare incontro a splicing, essendo un RNA ovviamente si deve portare dietro un RNA polimerasi RNA dipendente che è schematizzata in questa figura: è costituita da tre subunità PA, PB1, PB2 e la subunità PB1 porta legate tutte e due le estremità 3' e 5' dell'RNA genomico a polarità negativa. Tutti questi 8 frammenti di nucleocapsidi devono raggiungere il nucleo. Uno dei motivi ve l'ho già detto un paio di volte è che questa RNA polimerasi RNA dipendente per funzionare ha Simone Pisu Sezione Appunti Virologia molecolare bisogno di un innesco. Quali sono le polimerasi che sempre hanno bisogno di un innesco? Le DNA polimerasi, molte RNA polimerasi RNA dipendenti dei virus riescono a trascrivere anche senza un innesco, un' eccezione ma non unica è rappresentata dalla polimerasi dell'RNA, che cosa si è pensato? Vado nel nucleo dove trovo pre-RNA messaggeri cellulari, taglio un pezzettino di questo RNA messaggero cellulare e lo utilizzo per l'innesco per la trascrizione virus specifica. Va nel nucleo vedremo tra poco come, taglia un pezzetto di cap ed ecco che la polimerasi utilizza questo frammento derivato dal messaggero cellulare come innesco per la sintesi degli RNA messaggeri virali. Osserviamo le cose un po' più da vicino, abbiamo visto come il virus si spoglia e come vengono liberati gli 8 nucleocapsidi; questi 8 nucleocapsidi grazie all'importina alfa e all'importina beta riescono a lasciare il citoplasma e attraverso un poro nucleare arrivare nel nucleo. Cosa deve fare ciascun frammento? Ovviamente per prima cosa deve essere trascritto nel corrispondente messaggero perché questa è l'unica possibilità che ha il virus per esprimere la propria informazione genetica; quindi ingresso dei nucleocapsidi e grazie all'intervento della RNA polimerasi RNA dipendente siamo, al passaggio 2, formazione di RNA messaggeri che hanno un cap di derivazione cellulare. Una volta che si sono formati questi RNA messaggeri ovviamente devono andare per poter essere tradotti nel citoplasma dove la cellula metterà a disposizione del virus i propri ribosomi e tutto il proprio macchinario proteino-sintetico. Cosa succede quando l'enzima l'RNA polimerasi RNA dipendente deve sintetizzare i propri messaggeri? Abbiamo visto che è costituito da tre subunità, di una delle subunità la PA non conosciamo ancora il funzionamento, in questo schema sono presenti soltanto le altre due subunità che sono la PB2 e la PB1. Quale è il ruolo della PB2? Il ruolo della PB2 è quello di legarsi ad un RNA messaggero cellulare non ancora rimaneggiato e di associarsi con questo RNA messaggero cellulare PB2 lo fissa, dopo di che interviene la PB1 che cliva l' RNA messaggero cellulare ad una lunghezza che va da 10 a 13 ribonucleotidi e una volta che c'è questo frammento derivato da un messaggero cellulare la PB1 lo può utilizzare come innesco e cominciare a copiare il genoma virale realizzando così la formazione di un RNA messaggero specifico virale. Una cosa non vi ho detto la subunità PB1 fa tutto questo, ossia copia il genoma negativo in positivo rimanendo legata all'estremità 5' del genoma, questo diciamo è indicato dalla figura non progressivamente ma facendo vedere questa subunità della polimerasi con un cerchio colorato più debolmente e con i margini tratteggiati. Si è conquistato un cap, la PB1 comincia a copiare e fa tutto questo restando ancorata all'estremità 5'. Quando il processo di trascrizione va avanti e siamo nelle vicinanze dell'estremità 5' la lettura incontra una sequenza di poli U è l'RNA polimerasi RNA dipendente si dice che legge incominciando a balbettare, ossia quando sta leggendo questa sequenza di poli U va avanti e indietro, cosa comporta questo? Comporta la sintesi di una catena di poli A che caratterizza tutti quanti gli RNA messaggeri degli eucarioti che possono essere così trasportati dal nucleo al citoplasma dove possono essere tradotti, però è importante la modalità di sintesi, la modalità con cui un messaggero si procura una coda di poli A nell'influenza è diversa da quello che avviene nelle cellule eucariotiche. Nelle cellule eucariotiche abbiamo un enzima che cliva nel sito dove deve essere aggiunta la coda di poli A che poi viene assemblata da un'altra attività Simone Pisu Sezione Appunti Virologia molecolare enzimatica che viene legata a questi RNA messaggeri in via di completamento e poi tutto e pronto per viaggiare nel citoplasma. Invece no, e non è un caso, vedremo tra poco perché il virus dell'influenza fa parte del processo di trascrizione, comincia a sintetizzare va avanti e leggendo più volte questa sequenza di poli U riesce a crearsi una coda di poli A. Finchè finalmente la subunità PB1 si stacca e arriviamo alla sintesi di un messaggero virale che avrà un cap in 5' di origine cellulare e una coda di poli A alla sua estremità 3'. Questi messaggeri vanno nel citoplasma dove possono essere tradotti, ovviamente ha preso gli RNA messaggeri, li ha capitozzati e capite immediatamente che ha dato un bel colpo alla famosa competizione con gli RNA messaggeri cellulari ma non si ferma qui ,una delle funzioni della proteina NS1 è quella di legarsi a due proteine cellulari che sono la CPSF ed il fattore PAB. Qual è il ruolo nella cellula di queste due proteine? La prima CPSF, in un messaggero cellulare, è il fattore responsabile di tagliare il messaggero nelle vicinanze del punto in cui deve essere inserita la coda di poli A: c'è un messaggero in via di formazione, un'attività enzimatica, siamo all'estremità 3', lo taglia e individua così il sito di poliadenilazione; la seconda attività enzimatica PAB ha il compito di facilitare l'inserzione della coda di poli A perché questo è importante? Perché la proteina NS1 blocca queste due attività enzimatiche e da un'altra mazzata in testa agli RNA messaggeri cellulari, da una parte gli ha tagliato la testa da l'altra grazie all'intervento della NS1 blocca la poliadenilazione degli RNA messaggeri ed ecco che in fase nucleare i messaggeri cellulari vengono distrutti. Un colpo da una parte ed un colpo dall'altra: prende diciamo più messaggeri virali e dall'altra abbiamo una degradazione invece dei messaggeri cellulari. Abbiamo visto come l'RNA messaggero ha ottenuto un cap e una coda di poli A, può andare in sede citoplasmatica, ecco che questi RNA messaggeri andranno nel citoplasma dove potranno essere tradotti nelle proteine virali. Una volta che sono state sintetizzate le tre subunità che compongono la polimerasi e la nucleoproteina dal citoplasma si rilocalizzano nel nucleo e adesso abbiamo la possibilità che si abbia la formazione di un anti-genoma cosa vuol dire questo?? Sino ad adesso abbiamo avuto sintesi di RNA messaggeri, l'enzima aveva necessità di un cap, l'ha rubato alla cellula, man mano che aumenta la quantità di nucleoproteina che entra nel nucleo la polimerasi acquisisce la capacità di trascrivere in assenza di un innesco. Questo consente di sintetizzare delle molecole di RNA a polarità positiva che non avranno funzione di messaggero ma che funzioneranno invece come anti genoma. Ve lo ricapitolo perché forse non sono stata chiara: all'inizio è arrivato nel citoplasma un nucleocapside che portava con se un RNA polimerasi RNA dipendente che è riuscita a sottrarre un cap ai messaggeri cellulari e in questa configurazione l'enzima cosa sa fare? Sa sintetizzare gli RNA messaggeri, questi RNA messaggeri vanno nel citoplasma, vengono tradotti nelle proteine ed ecco che la proteina nucleocapsidica e le tre subunità dell' RNA polimerasi ritornano nel nucleo; man mano che la quantità di nucleoproteina aumenta nel nucleo ecco che si ha un cambiamento nel funzionamento dell'RNA polimerasi RNA dipendente, acquista la capacità di trascrivere il genoma a polarità negativa anche in assenza di un cap e questo è importante perchè riesce a copiare per intero il genoma del virus influenzale portando alla formazione di un anti genoma positivo. Che ruolo avrà questo anti genoma a polarità positiva? Simone Pisu Sezione Appunti Virologia molecolare Farà da stampo per la formazione di nuovi genomi a polarità negativa. Esattamente come questo avvenga non lo sappiamo però è stato dimostrato che con bassi livelli di nucleoproteina abbiamo sintesi di mRNA, mentre con elevati livelli di nucleoproteina abbiamo replicazione del genoma. Funge il genoma del virus da stampo per la formazione di anti-genomi a polarità positiva che a loro volta saranno stampo per la formazione di nuovi genomi. Siamo al punto che nuovi genomi e nuovi nucleocapsidi del virus influenzale si stanno accumulando nel nucleo; nel frattempo a livello della membrana citoplasmatica della cellula si sono inserite glicoproteine emoagglutinina e neuroaminidasi il problema da risolvere a questo punto è come far tornare indietro i nuovi nucleocapsidi, il loro trasferimento dal nucleo al citoplasma è possibile grazie all'intervento della proteina di matrice e della proteina NS2. Anche queste due proteine, appena sintetizzate nel citoplasma, tornano nel nucleo da prima prende contatto con il nucleocapside la proteina M2 e a questa proteina M2 si lega la proteina NS2 che è appunto responsabile di condurre questi segmenti dal nucleo nel citoplasma. A questo punto deve viaggiare nel citoplasma fino a trovare quelle porzioni di membrana citoplasmatica, sono porzioni particolarmente ricche in colesterolo, dove sono state inserite l'emoagglutinina e la neuroaminidasi. Ed è appunto in questa diapositiva che è diciamo rappresentata lo stadio finale del processo di maturazione del virus, grazie all'intervento della proteina di matrice e dell'NS2 i segmenti fatti dal genoma e rivestiti da proteine quindi i nucleocapsidi con l'intervento della proteina di matrice e dell'NS2 hanno raggiunto il citoplasma, la membrana citoplasmatica nel frattempo si sono inserite l'emoagglutinina e la neuroaminidasi, la matrice si dispone all'interno di queste porzioni di membrana citoplasmatica, i nucleocapsidi si fissano alla proteina di matrice, il virus può fuoriuscire attraverso un processo di gemmazione, ma mentre sta gemmando c'è un rischio: il rischio che questa è la cellula, qui vedete un processo di morfogenesi in via di completamento, e questo è invece un processo di morfogenesi quasi completamente realizzato. C'è il rischio che le emoagglutinine, alla superficie di questo virus neoformato, siano come dire bloccate dall'acido sialico della cellula infettata che tende a trattenerle, e questo è impedito dall'intervento della seconda glicoproteina di superficie rappresentata dalla neuroaminidasi. Cosa fa la neuroaminidasi? La neuroaminidasi scinde il legame tra emoagglutinina e acido sialico ed ecco che il virus completamente libero in ambiente extracellulare è pronto per andare ad infettare un'altra cellula. La neuroaminidasi libera l'emoagglutinina, l'emoagglutinina riconosce l'acido sialico, l'acido sialico presente su questa cellula tende a ricatturare l'emoagglutinina impedendo al virus di liberarsi, quindi il ruolo è di consentire il completo rilascio del virus rompendo il legame tra emoagglutinina e acido sialico. La sua funzione è anche importante nel muco, quando il virus dell'influenza arriva nell'epitelio respiratorio nel muco c'è abbondanza di acido sialico, se l'emoagglutinina si fissa su questo acido sialico perde la possibilità di raggiungere la cellula ospite, di conseguenza è necessario l'intervento della neuroaminidasi che rompe questo legame, dicendo puoi continuare la tua strada nelle vie respiratorie fino finalmente a trovare un emoagglutinina localizzata su una cellula che può diventare la cellula ospite. Perché è stato chiamato virus dell'influenza? Simone Pisu Sezione Appunti Virologia molecolare
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