Il virus dell'epatite B

 
Sono dei virus che hanno tra loro stili di vita completamente differenti, però c'è qualcosa che li accomuna, sono tutti virus che sono in grado, una volta avvenuta l'infezione, di cronicizzare perperiodi anche molto lunghi. Perché, diciamo, questa scelta è una scelta vantaggiosa proprio per la modalità di trasmissione con cui questi virus si sono evoluti. Si infetta una donna, nel lungoperiodo in cui il virus rimane cronico, possibilità che questa donna abbia, una volta che ovviamente è incinta, la possibilità di trasmettere il virus alla progenie. 

 

Incominciamo oggi a parlare del virus dell'epatite B.
Sono numerosi i virus che causano un infezione a livello epatico, vengono numerati con la lettere dell'alfabeto da A a G, e i più importanti sono sicuramente i virus dell'epatite A, dell'epatite B e dell'epatite C è una nomenclatura questa relativamente recente, prima questi virus erano denominati tenendo conto degli aspetti epidemiologici, oppure delle manifestazioni cliniche che determinavano, per esempio l'epatite B era chiamata epatite da siero, e come vedremo tra poco è trasmessa dal sangue; il virus dell'epatite A, di cui abbiamo già parlato... scusate non vi ho detto che il virus dell'epatite B appartiene alla famiglia degli Epadnaviridae; il virus dell'epatite A abbiamo già visto appartenere invece ai Picornavirus, e il virus dell'epatite C (originariamente definito virus dell'epatite non A e non B) e più recentemente denominato come virus dell'epatite C, fa parte della famiglia dei Flaviviridae. 

Anche all'interno dei virus dell'epatite, molta diversità nel ciclo di replicazione virale, che cosa accomuna il virus dell'epatite A, B e C? 

Sono accumunati dal fatto che il bersaglio, cioè la cellula all'interno della quale il virus replica, è rappresentato da un epatocita.

La prima scoperta dell'epatite B, siamo nel 1963, quando Blumberg trova nel sangue una proteina sconosciuta; questa proteina era stata isolata da un aborigeno australiano e questa proteina viene definita come antigene Australia e ben presto si vide che questa proteina era connessa ad una infezione virale. Dieci anni dopo nel 1973 Dane scopre delle particelle virali che risultavano essere appunto particelle virali di HBV. Subito dopo una cosa strana venne scoperta in questi virus, che proprio dal nome del loro scopritore venivano chiamate particelle di Dane era la presenza di una trascrittasi inversa. La trascrittasi inversa fino a quegli anni era conosciuta soltanto nei retrovirus e fu una scoperta del tutto inattesa. 

 
Qual è una peculiarità del virus dell'epatite B? È che ha un genoma costituito da DNA, però nel corso del ciclo replicativo di questo virus l'intera informazione genetica contenuta nel DNA genomico dell'HBV passa ad una molecola di RNA che funge da stampo ed è retrotrascritto per essere nuovamente convertito in genomi a DNA. 

Un'altra caratteristica dell' HBV è quella di avere una informazione genetica estremamente limitata, ha infatti un contenuto di DNA pari a 3.2 Kb, 3200 nucleotidi che consentono al virus di arrivare a sintetizzare 7 proteine.
Proprio per questa pochezza di informazione, c'è la capacità da parte di questo virus di sfruttare al massimo questa informazione. Praticamente tutti i 3200 nucleotidi sono impiegati come punto di partenza e portano un'informazione per la sintesi di una proteina, e molti nucleotidi vengono sfruttati più di una volta.
Come fa un nucleotide ad essere sfruttato più di una volta?

Il genoma è un genoma circolare, parzialmente bicatenario e i geni hanno la caratteristica di essere sovrapposti, cosa vuol dire? Un determinato segmento genico partecipa secondo diversi moduli di lettura alla sintesi di diversi messaggeri (lo vedremo tra poco in maggiori dettagli). 

 
Qui abbiamo una prima diapositiva molto schematica che ci consente di introdurre il virus dell'epatite B, il bersaglio ve l'ho già detto sono le cellule epatiche, si tratta di un virus dotato di envelope, grosso modo una quarantina di nm di diametro, all'interno dell'envelope un capside che contiene il genoma.
Anche il genoma è piuttosto peculiare, vi ho detto che è un genoma circolare bicatenario, e sottolineiamo subito che una sola di queste due catene del genoma bicatenario, e precisamente la catena negativa (la catena più chiara colorata in violetto) è completa, mentre la catena complementare non lo è, di conseguenza il genoma per un tratto risulterà monocatenario. 

Nella parte bassa di questa figura, proprio in maniera estremamente semplice, si vedono i punti salienti di un ciclo replicativo. Abbiamo un DNA bicatenario parzialmente circolare, che funge da stampo per la replicazione dei trascritti, l'enzima utilizzato per il processo di trascrizione è l'RNA polimerasi cellulare e questo genoma funge da stampo sia per la formazione di mRNA, perché il virus possa arrivare alla sintesi delle proteine sito specifiche e dov'è la stranezza? La stranezza è qui, il DNA bicatenario non solo funge da stampo per la formazione di messaggeri nella trascrizione, ma funge anche da stampo per una molecola di RNA che contiene tutta l'informazione genetica dell'HBV. Questo RNA deve essere retrotrascritto perché si formino nuovi genomi di HBV; ed ecco che nella particella virale è presente un particolare enzima che è appunto una trascrittasi inversa, che ha il compito su questo stampo di RNA a singola catena di sintetizzare DNA circolare parzialmente bicatenario. Vedremo poi come ha causa del particolare processo morfogenetico la catena positiva di DNA in una particella di virus completo rimane non completamente sintetizzata.

Qui in maggiori dettagli su come è fatta una particella HBV. Vi dicevo che è fornito di un envelope, rispetto all'envelope di altri virus quello di HBV contiene una quantità molto piccola di lipidi e le 3 proteine virali sono rappresentate da 3 proteine di superficie indicate come M, L ed S.
L sta per large è la proteina superficiale di maggiori dimensioni e la vedremo tra poco responsabile del processo di adsorbimento dell'HBV. La proteina superficiale di dimensioni intermedie è indicata con M da middle e infine la più piccola che è anche la più abbondante è la proteina small, queste 3 proteine sono localizzate nell'envelope.

All'interno dell'envelope un core capsidico di forma icosaedrica formato dalla proteine C che contiene appunto il genoma, ed associata al genoma la polimerasi.

Questa polimerasi funziona come trascrittasi inversa, che attività enzimatiche svolge? Ne svolge 3:
1. Sa fungere da DNA polimerasi RNA dipendente cioè sintetizza DNA su stampo di RNA.
2. È dotata anche di attività di RNasi H mentre copia il DNA su stampo del RNA, l'RNA contemporaneamente viene degradato;
3. e infine la terza attività enzimatica è quella di DNA polimerasi DNA dipendente. Una volta che ha copiato lo stampo ad RNA si forma una catena lineare di DNA che poi proprio grazie alla sua capacità di funzionare da DNA polimerasi DNA dipendente riporterà alla sintesi di genomi circolari di DNA parzialmente bicatenari.

Non abbiamo ancora molte informazioni sul virus dell'epatite B perché dipende dal fatto che non abbiamo ancora a disposizione una coltura cellulare che sia in grado di sostenere la replicazione dell'HBV, soltanto le moderne tecniche consentono di transfettare diversi tipi di colture cellulari. Cosa vuol dire? Cloniamo il genoma dell'HBV artificialmente lo facciamo entrare in cellule in coltura il virus replica e da qui possiamo avere ovviamente molte informazioni sulle modalità del suo ciclo replicativo. 

 
Un'altra caratteristica è che una volta che nell'epatocita il virus replica produce nuove particelle di HBV che vengono riversate all'esterno, però oltre che particelle complete, questa che sto indicando è una particella virale, vedete l'envelope con le 3 proteine L,M ed S e all'interno colorato in azzurro il core che racchiude il genoma. Oltre che particelle complete il virus produce anche delle particelle vuote, cosa vuol dire particelle vuote? Se una particella di Dane abbiamo detto ha una quarantina di nm in diametro ci sono affiancate in numero molto maggiore anche queste particelle vuote di circa 22nm di diametro. Da che cosa sono costituite queste particelle? Sono costituite dalla proteine superficiali del virus, però queste particelle all'interno sono vuote, non contengono il core con all'interno il genoma, quindi capite immediatamente come di conseguenza queste particelle non sono infettanti. Accanto a queste particelle di questi 22nm ci sono anche particelle allungate (anche queste vuote). I virus quindi, particelle virali complete infettanti e queste particelle non infettanti, sia di forma sferica, sia di forma allungata.
Uno potrebbe dire ma perché il virus fa questo? Spreca un sacco di proteine per produrre particelle non infettanti, vedremo che per il virus questa è una strategia molto importante che gli consente di sottrarsi alla risposta anticorpale. Quindi particelle non infettanti composte principalmente da lipidi e da proteine di superficie dell'HBV, sia filamentose o sferiche, sono prive di core, non contengono il genoma, né contengono la trascrittasi inversa. 

Per quanto riguarda la suddivisione dell'HBV possiamo riconoscere guardando la diversità genotipica 8 diversi ceppi di HBV.
Sono distribuiti nel mondo in maniera diversa, ossia la loro prevalenza è geograficamente differente, e invece se andiamo a guardare la diversità dei sierotipi, ossia facciamo una classificazione in base a quali anticorpi sono in grado di legarsi alla superficie del virus, possiamo distinguere 4 differenti sierotipi di HBV.
L'unico ospite è l'uomo, sapete che da pochi anni abbiamo a disposizione un vaccino. Il fatto che l'uomo sia l'unico ospite potrà portare nel tempo ad eradicare questa infezione da virus come già in precedenza è successo con il vaiolo. 

Il ciclo replicativo dell'epatite B     

Ancora una volta incominciamo esaminando in maniera schematica il ciclo replicativo:
 questa è una particella virale, si adsorbe all'epatocita e si ritiene (anche se non tutti sono d'accordo) che l'envelope virale si fonda con la membrana citoplasmatica della cellula liberando il core che contiene il genoma nel citoplasma; dopo di che il core arriva a livello della membrana nucleare e il genoma viene liberato nel nucleo della cellula infettata.
Arrivati nel nucleo il primo processo, vi ho detto che il genoma è parzialmente bicatenario, la catena incompleta viene chiusa, si forma un DNA siglato ccc che vuol dire: circolare, covalentemente legato, chiuso.
Quindi due molecole circolari chiuse covalentemente, sono il risultato di questa prima fase di replicazione a livello nucleare.
Come vi ho già detto prima questo DNA riparato e completo è lo stampo sia per la formazione di messaggeri, sia per la formazione di molecole di RNA, che contenendo tutta l'informazione genetica del virus, saranno depositarie dell'informazione genetica e grazie all'intervento della trascrittasi inversa potranno essere riconvertite in quello che era l'originario genoma del virus, molecole di DNA circolare parzialmente bicatenario. 

 
Dove avviene questo processo di retrotrascrizione? Avviene all'interno delle proteine del core che si stanno assemblando nel citoplasma.
Dopodiché a livello del reticolo endoplasmatico, si è formato un core che racchiude un genoma, a livello del reticolo endoplasmatico questa particella in via di maturazione si arricchirà dell'envelope per poi essere eliminata in ambiente extracellulare.
Una cosa importante circa la liberazione di nuove particelle di HBV è che la produzione di virus non si accompagna alla morte cellulare; il virus viene prodotto ma la cellula rimane integra, e questo crea dei problemi per il sistema immunitario.
Chi è che mi ricorda l'importanza di questa modalità di fuoriuscita, come dire, indolore per la cellula? Il punto di partenza qual è? Il punto di partenza è che quando un virus uccide la cellula distruggendola di conseguenza ci saranno moltissimi frammenti derivati dalla distruzione della cellula, i macrofagi incominciano a mangiare alla disperata, lanciano citochine. Quindi i detriti cellulari sono, come dire, insieme alla produzione di interferon, un segnale importante, diciamo che induce i macrofagi a produrre citochine e le cellule che raccolgono tutte queste informazioni, le cellule dendritiche, vanno ad attivare la risposta immunitaria di tipo adattativo.
È chiaro che se un virus non uccide la cellula non avremo accumulo di detriti, cioè guadagna tempo prima che si abbia l'attivazione della risposta immunitaria di tipo innato.

Vediamo adesso i vari momenti di questo ciclo replicativo, così, lo definirei bizzarro, di questo virus.
Vedremo che spesso, proprio perché usano una trascrittasi inversa, si paragona il virus dell'epatite B, all'HIV e agli altri retrovirus. Anche i retrovirus hanno una trascrittasi inversa, ma ci sono profonde differenze. Nel caso che stiamo esaminando il genoma è a DNA, viene copiato in una molecola di RNA nel corso del ciclo replicativo, che poi viene retrotrascritta. Nel caso dei retrovirus, parleremo sia dell'HIV sia dell'HTLV-1, il genoma è ad RNA, viene convertito dalla trascrittasi inversa in un DNA bicatenario che poi si integra nel cromosoma della cellula ospite. Questo DNA, diciamo integrato nel genoma dell'ospite verrà poi copiato dalla polimerasi cellulare, che avrà trascritto per ritornare ad avere dei genomi costituiti da RNA come la particella originaria infettante di retrovirus.
Quando abbiamo trattato l'HBV e successivamente i due retrovirus, saremo in grado di esaminare nei dettagli le omologie e le diversità tra questi due gruppi di virus che utilizzano la trascrittasi inversa.
Vi dicevo all'inizio che nell'envelope troviamo 3 proteine superficiali, la S, la M e la L. Tra queste la small, la più piccola, che poi costituisce l'antigene Australia originariamente individuato, è la più abbondante. In che cosa differiscono? Praticamente la proteina M e le proteine L sono versioni più lunghe della proteina S.
La proteina S la vedete qua localizzata a livello della membrana citoplasmatica, lo stesso per la proteina M che è leggermente più lunga, ed infine la più grande che è la proteina L.
Tutte e 3 queste proteine possiedono dei siti di glicosilazione, in aggiunta la proteina L alla sua estremità N terminale è miristilata. Dicevo prima che grazie alla sovrapposizione di geni, la stessa sequenza genica è letta secondo diversi schemi di lettura, così il virus riesce a sfruttare al massimo la propria informazione genetica. La proteina L ci offre un altro esempio di questo virus, che con una informazione genetica così limitata, la sfrutta al massimo. 

La proteina L esiste in due differenti conformazioni, cosa vuol dire? La sua estremità N-terminale, che vi ho appena detto essere miristilata, può essere rivolta sia verso l'ambiente extracellulare, che all'interno dell'envelope. Lo vedete qua, in questo caso la proteina L ha la sua estremità N-terminale rivolta verso il core, quindi all'interno dell'envelope; qui invece questa estremità N-terminale è rivolta verso l'ambiente extracellulare, ma perché diciamo che questo virus fa questo, è abbastanza semplice capirlo: quando questa estremità N terminale è rivolta all'interno della particella virale assolve il compito di legare l'envelope al sottostante core capsidico, mentre quando è rivolta in ambiente extracellulare si ritiene che qui sia localizzato l'antirecettore responsabile del legame del virus HBV all'epatocita.
Quindi giocando su due differenti conformazioni la stessa proteina assolve due funzioni ben distinte tra di loro.
Non sappiamo molto su come avviene l'attacco, tutta una serie di proteine superficiali sono chiamate in causa, come recettori dell'HBV, si chiama in causa l'apolipoproteina, la fibronectina e l'interleuchina-6, però attualmente, precisamente quale di queste assolva il preciso compito di recettore per questo virus non è stato ancora determinato.
Come vi ho detto un minuto fa, l'antirecettore è localizzato nella proteina L quando la sua estremità N terminale è rivolta verso l'esterno. Una volta che è avvenuto l'attacco, questa proteina L, si ritiene che subisca un qualche cambiamento nella sua conformazione, questo cambio conformazionale, probabilmente, libera una porzione idrofobica che è responsabile della fusione tra l'envelope virale e la membrana cellulare dell'epatocita. Quindi una fusione diretta con liberazione del core, che si dirige prima nel citoplasma e poi nel nucleo dove viene liberato il genoma virale.
Ripete: Quindi un processo di fusione seguito dal trasporto del genoma dal core verso la membrana nucleare e finalmente ingresso del genoma nel nucleo dove riesce ad esprimersi.
Ma prima di poter essere trascritto, questo genoma parzialmente bicatenario, deve essere completato, ed ecco che: questa disegnata in rosso è la catena positiva, appena arriva nel nucleo si ritiene ad opera di attività enzimatiche cellulari, ma non viene escluso l'intervento della trascrittasi inversa, viene convertito in un DNA bicatenario circolare completamente chiuso, ed è a questo punto che questo DNA può essere trascritto dalla RNA polimerasi DNA dipendente, che la cellula mette a disposizione al virus.
Vediamo un po' più nei dettaglio come è formato il genoma di questo HBV, che è il genoma che viene appena liberato nel nucleo.
Questa è la catena negativa completa, questa esterna incompleta è la catena positiva. Nella catena interna negativa all'estremità 5' porta legata la polimerasi, che abbiamo detto essere capace di comportarsi come una trascrittasi inversa. All'estremità invece 5' della catena positiva, quindi della catena incompleta è presente un CAP che porta legata una corta catena di RNA.
Le due catene sono legate insieme da delle sequenze DR1 e DR2, che vuol dire direttamente ripetute (su queste sequenze torneremo tra poco a parlare e vediamo che si originano nel corso di replicazioni del genoma).
Come vi dicevo un minuto fa, ad opera di attività enzimatiche cellulari, il primo passo è quello di completare la sintesi della catena incompleta. Dopodiché sempre ad opera di attività enzimatiche cellulari, vengono tagliati la polimerasi presente in 5' nella catena negativa e il CAP presente invece in 5' nella catena positiva, intervengono ligasi cellulari e arriviamo ad una molecola di DNA completa che finalmente può fungere da stampo in un processo di trascrizione con l'intervento del RNA polimerasi DNA dipendente della cellula.
Qui abbiamo schematizzata le porzioni codificanti del genoma dell'HBV, e questi sono il gene C, il gene P che sta per polimerasi, il gene S ed il gene X.
Questa mi sembra una figura migliore per spiegare cosa vuol dire sovrapposizione genica, voi guardate il gene P che costituisce circa l'80%, questo colorato in arancione, di tutta l'informazione genetica contenuta in questo virus. Guardate contiene l'intera informazione del gene S al suo interno, e l'informazione di P si sovrappone anche a C come pure ad X in questo tratto.
Ciò vuol dire che sequenze nucleotidiche lette in maniera diversa concorrono alla formazione di diverse proteine. Tutti i 3200 nucleotidi che costituiscono il genoma dell'HBV sono utilizzati per sintetizzare proteine. Però questo anche vuol dire che le regioni di controllo, come promotori, come enhancer, sono in sequenze nucleotidiche che sono anche sequenze codificanti, la cui informazione sarà convertita in proteine.
Quindi questo schema ci dice i 4 geni presenti, il C che codificherà il core; P è la polimerasi; S codificherà per le 3 proteine di superficie ed infine il gene X che codifica per la proteina X che però non è presente nella particella virale infettante, ed è questa la proteina che viene chiamata in causa per giustificare il potere oncogene dell'HBV.
Qui abbiamo una sorta di ingrandimento di una regione importante dell'HBV, è importante perché, allora epsilon, questo quadratino colorato in verde, che diciamo è il tratto genico che riconosce la polimerasi durante la fase di impacchettamento; poi abbiamo questo rettangolino arancione che è il sito di poliadenilazione, quindi il sito di termine della formazione degli mRNA e tutti i messaggeri che vengono trascritti sul genoma sono caratterizzati dal terminare in un unico sito di poliadenilazione.
Cosa c'è in questo strato di ancora molto importante, troviamo due promotori, il promotore che da origine al RNA che chiamiamo pg, vuol dire RNA pregenomico, ossia quel RNA che sarà da stampo per la formazione di nuovi genomi a DNA. In prossimità, pensate ad una distanza di soltanto 15 nucleotidi è presente un secondo promotore che invece da origine ad un mRNA chiamato preC. Sempre in questa zona abbiamo 3 sequenze direttamente ripetute, ossia sequenze identiche che sono... come DR1 e DR2. Vi ho già detto che queste sequenze sono molto importanti per consentire a questo virus il processo della sua replicazione.
Quindi ricapitolando che cosa abbiamo in questo tratto? Una sequenza epsilon in grado di legare la polimerasi virale, due promotori, uno che porta alla sintesi del RNA pregenomico e un promotore molto ravvicinato che invece consente la sintesi del RNA che invece chiamiamo pre C, sempre in questa sequenza genica il sito di terminazione della sintesi dei messaggeri e delle sequenze direttamente ripetute che indichiamo con DR1 e DR2. 

Quanti sono i promotori della polimerasi cellulare che riconosce il genoma dell'HBV? Sono 5 e sono i promotore pg e pre C che abbiamo appena visto con maggiori dettagli dove sono localizzati, poi abbiamo due promotori pre S1 e pre S2 e un quinto promotore che invece da il punto di partenza per la trascrizione dei geni che porteranno alla sintesi della proteina X. Qui abbiamo il risultato del riconoscimento di questi 5 promotori, questi 5 promotori portano alla sintesi di 5 classi di RNA. Di queste 5 classi vediamo che il peculiare è questa classe RNA pg, perché da una parte, come vi ho detto un minuto fa questo RNA funge da stampo per la formazione di nuovi genomi e da qui il suo nome RNA pregenomico, però funge anche da messaggero, ed è il messaggero responsabile della sintesi della polimerasi come pure delle proteine del core. Il messaggero più lungo che si forma dal promotore preC è quello che determina la sintesi della proteina E, di questa proteina non ne abbiamo parlato, è una proteina che il virus precocemente produce, però una volta che la produce, questa proteina viene secreta (ci fermiamo qui per il momento ci torniamo tra poco).
Quindi abbiamo 5 promotori, 5 classi di messaggeri, l'RNApg fa da stampo per la formazione di nuovi genomi ma porta anche l'informazione per la proteina del core e per la proteina polimerasi. L'RNA preC porta l'informazione per la proteina E. Invece dal promotore che si forma a partire da pre S1 è quello che tradotto darà luogo alla sintesi della proteina superficiale di maggiori dimensioni L, il promotore S porta alla formazione di un messaggero che tradotto porterà la sintesi delle proteine superficiali M ed S, ed infine l'ultimo promotore X porta alla formazione della proteina X, che come vi ho detto prima, è la proteina responsabile del potere oncogeno dell'HBV.

Qual è il ruolo di queste proteine?
La proteina X, diciamo non è noto nei dettagli il meccanismo di azione, anche se si cominciano ad accumulare tantissime scoperte su questa proteina, è implicata nello sviluppo dell'epatocarcinoma che per fortuna in bassa percentuale sviluppa in soggetti in cui l'HBV è riuscito a cronicizzare. Perché diciamo che è implicata nello sviluppo dell'epatocarcinoma? È una proteina che è risultata iperregolare nella produzione di diverse chinasi implicate nella trasduzione del segnale abbiamo per es. la Sar chinasi, il pathway jack-stat che abbiamo visto quando abbiamo esaminato nei dettagli l'interferon, quindi proteine che localizzate sulla superficie della cellula svolgono un ruolo determinante per trasmettere un segnale a livello del nucleo dove l'attivazione di determinati fattori di trascrizione porterà come risultato finale la sintesi di particolari proteine. Altro meccanismo di azione della proteina X che la fa ritenere coinvolta nello sviluppo di epatocarcinoma è che questa proteina è in grado di sequestrare la p53, ne abbiamo già parlato, il famoso guardiano del genoma, il DNA della cellula viene danneggiato oppure la cellula viene infettata ecco che questa proteina, come dire, fiuta l'ambiente e capisce se quella cellula può farcela a riparare il danno e in quel caso tutto si rimette apposto, se la cellula è danneggiata in maniera irreversibile è la proteina responsabile di indirizzare la cellula verso la via apoptotica, verso la morte. La proteina X sequestra la p53, la p53 non si può accumulare, ed ecco che in quella cellula il fenomeno dell'apoptosi viene inibito. Un'altra modalità di azione della proteina X è sempre quella di inibire l'apoptosi, che viene realizzata dal TNF, fattore che agisce partendo dalla superficie della cellula, anche lui come risultato finale è quello di fare imboccare alla cellula la via apoptotica. Molti studi, ma è ancora uno dei fattori, ci torneremo alla fine della lezione, su come questo virus è implicato nell'insorgenza di tumori a livello epatico.
Delle altre proteine, abbiamo le 3 proteine di superficie, delle quali abbiamo già parlato, vi ricordo che queste proteine le troviamo tutte e 3 nell'envelope di una particella completa di HBV e le proteine S ed M le troviamo anche in quelle particelle vuote che, insieme a quelle complete, vengono eliminate dalla cellula infettata.
Non so se ve l'ho detto, è importante sottolineare, che queste particelle vuote rispetto alle particelle virali complete sono molto ma molto più numerose. Una particella virale completa viene eliminata dall'epatocita contemporaneamente si producono 1000 particelle vuote di quelle sferiche di 22nm e come vi ho già detto è una astuzia del virus, non è uno spreco, per contrastare la difesa anticorpale.
La proteina del core è appunto la proteina che va a formare l'involucro icosaedrico che contiene il genoma ed inoltre abbiamo un'altra proteina: la proteina E (E sta per early), che è la prima proteina virale che viene riscontrata nel siero di un paziente infetto. Non conosciamo la funzione di questa proteina, quello che sappiamo è che viene prima trascritta poi tradotta, una volta tradotta va nel reticolo endoplasmatico e poi viene secreta all'esterno. Alcuni studi, ma senza risultati ancora sicuri, ritengono che possa in qualche modo contrastare la risposta immunitaria.
Ed infine l'ultima proteina, che direi è proprio il primo attore del ciclo replicativo dell'HBV è la polimerasi. Questo è lo schema dell'informazione contenuta in questa proteina, la sua estremità N-terminale. Vi ricordate che nel genoma c'era quella sequenza epsilon, ecco si lega alla porzione terminale della polimerasi; c'è poi in questa sequenza amminoacidica uno spaziatore, segue l'attività di trascrittasi inversa, vi ho già detto che è la capacità di sintetizzare DNA utilizzando uno stampo di RNA. Infine siamo arrivati all'estremità carbossi-terminale, attività di RNasi H, mentre retrotrascrive degrada l'RNA stampo, si avrà prima un intermedio a DNA a singola elica che poi viene convertito in un DNA bicatenario.
Eccolo qui il nostro genoma, con i suoi 5 promotori e questo lo abbiamo già esaminato è il risultato degli RNA sintetizzati, di questi RNA, vi dicevo prima, che dal promotore pre S1 il messaggero porta l'informazione per la sintesi della proteina L, mentre il messaggero che si forma dal promotore S porta l'informazione per la sintesi delle proteine superficiali M ed S. Come succede, un unico messaggero a livello dei ribosomi, questo messaggero riconosce due punti di inizio, un punto di inizio porterà alla sintesi della proteina superficiale M, partendo da un altro sito di inizio arriveremo alla sintesi della proteina di superficie più piccola S. Quindi abbiamo sistemato il messaggero da pre S1 a S, e vi ho anche già detto che il promotore pg oltre che portare alla sintesi di un RNA stampo, quindi di un RNA pre genomico, ha l'informazione per la proteina del core e per la polimerasi. Vi ho appena finito di parlare delle proteine superficiali, mi sono dimenticata di dirvi che abbiamo qui la localizzazione della sintesi delle 3 proteine superficiali L, M, S che avviene a livello del reticolo endoplasmatico, vengono sintetizzate in questa sede, rimangono in questa sede e vedremo svolgeranno il loro ruolo nel processo di morfogenesi del virus.
Un'altro ruolo, diciamo, tornando alla sintesi a partire la promotore pg, è quello di avere l'informazione per la proteina del core C e per la proteina P, vediamo qua, questo è il messaggero dove la sintesi è partita da pg, anche in questo caso due siti di riconoscimento in questo RNA messaggero, ovviamente sono tutti messaggeri monocistronici, quella che viene infettata è una cellula eucariotica, con maggiore frequenza viene riconosciuto il sito d'inizio della proteina C. Chi è che mi dice perché? Qual è la logica? Abbiamo questo messaggero a livello dei ribosomi, possibilità di riconoscimento di due differenti siti di inizio. Perché viene letto molto più frequentemente a partire dal sito di inizio di C che non P? Ne serve molto di più, C è una proteina strutturale che servirà a formare il core delle nuove particelle virali, P è un attività enzimatica ne bastano molte meno copie affinché questa proteina svolga il suo ruolo in maniera catalitica.

Torniamo al nostro ciclo replicativo, quindi siamo partiti da questo genoma che è arrivato nel nucleo è stato reso completo, circolare e bicatenario, grazie all'intervento dell'RNA polimerasi cellulare abbiamo visto come si formano i trascritti e più volte ormai abbiamo anche sottolineato, come uno di questi prodotti del RNA non funge da messaggero ma svolge un ruolo importante nel proseguire il ciclo replicativo dell'HBV. Da una parte abbiamo appena finito di dire questo RNA porta alla formazione di C e P, la proteina del core e la polimerasi, però funge anche da pregenoma. Ecco che una volta che è sintetizzato questo RNA va nel citoplasma dove viene racchiuso dalle proteine del core, ed è proprio man mano che queste proteine del core racchiudono il pregenoma si realizza il processo di retrotrascrizione. Cosa vuol dire? Quindi, tutta l'informazione genetica dell'HBV è presente in questo pregenoma ad RNA, eccolo qua, se noi andiamo a guardare questo che vedete colorato in verde è il nostro RNA pregenomico che è lo stesso RNA che porta anche l'informazione per la sintesi di C e di P. Questo è l'inizio, qui c'è il promotore, copia la catena negativa di DNA, la copia completamente, ma ad un primo giro sorpassa il punto in cui viene aggiunta la coda di poli A ed ecco che un tratto del DNA viene copiato due volte. Qui esiste, alla fine di questa freccia, nel DNA è presente un punto di poliadenilazione. Uno dice: come l'RNA viene trascritto incontra il punto di poliadenilazione cessa la trascrizione e l'RNA viene liberato... questo NON succede nel HBV. La prima volta durante la trascrizione la polimerasi ignora il sito di terminazione di poli A, trascrive tutto quanto lo stampo e soltanto quando passa per la seconda volta che arrivata al sito di poli A la trascrizione si ferma. In questo modo vedete, che in questo tratto l'informazione è presente in una tripla elica. Ed ecco questo pregenoma ad RNA che così si è formato, che cosa c'è di caratteristico in questo pregenoma? All'estremità 5' abbiamo una sequenza ripetuta diretta indicata come DR1; e due sequenze identiche ripetute indicate come diretta 2 e diretta 1, le troviamo all'estremità 3'. Poi abbiamo in vicinanza dell'estremità 5' una struttura secondaria epsilon, che è importante perché lega la polimerasi, e a questo punto, diciamo questo pregenoma nel citoplasma prende contatto con le proteine del core e può incominciare il processo di retrotrascrizione.
Come avviene il processo di retrotrascrizione?
È un processo piuttosto complesso, in questa figura è notevolmente semplificato. Questo è il punto di partenza, un RNA pregenomico, abbiamo appena finito di dire che è caratterizzato da un CAP in posizione 5', da una sequenza DR1 sempre in 5', da una sequenza DR2 e DR1 in prossimità 3', una struttura secondaria epsilon nelle vicinanze delle estremità 5' che ha il ruolo di legare la polimerasi, vedete questa sferetta arancione, questa è appunto la polimerasi dell'HBV capace di comportarsi come una trascrittasi inversa. Anche all'estremità 3' è presente questa sequenza epsilon che si ritiene essere importante nella fase di impacchettamento del genoma all'interno delle proteine del core. Cosa succede? Ecco che la polimerasi una volta che si è legata alla sequenza epsilon incomincia a copiare l'RNA (nella figura è di colore nero) è forma un breve tratto di DNA (colorato in rosso) accoppiando praticamente il segmento DR1, una volta che questo si è realizzato la polimerasi con questo corto frammento di DNA neo sintetizzato fa un salto e si può spostare all'estremità opposta dove per complementarietà, questa breve catena di DNA neosintetizzata potrà legarsi alla DR1 presente all'estremità 3'. Queste sequenze 1, 2, 3 sono sequenze identiche tra di loro; ha copiato la sequenza DR1, corto frammento di DNA (in rosso) legato alla polimerasi salta e va a legarsi alla sequenza DR1 localizzata nelle vicinanze dell'estremità 3'. A partire da questo punto la polimerasi può copiare tutto lo stampo ad RNA e si va formando così la catena di DNA negativa; man mano che procede la sintesi di questa catena di DNA negativa (colorata in arancione), l'RNA stampo viene degradato, questo RNA stampo però non viene completamente degradato, rimane intatta la porzione in prossimità del 5' rappresentata dal CAP e dalla sequenza DR1.
Quindi abbiamo una catena di DNA negativa neo sintetizzata, ed è rimasto dello stampo ad RNA un corto frammento DR1 che si porta legato il CAP. Altro salto, questo CAP con al sequenza DR1 per complementarietà va a legarsi al DR2 presente nella catena di DNA negativa neo sintetizzata. Si è spostato da qui, ha fatto un salto. A questo punto può fungere da punto di inizio per copiare quest'altra sequenza in questo disegno indicata come DR1' e si forma un'altra volta un CAP con una corta sequenza di DNA, quella che stiamo sintetizzando adesso è la catena positiva, altro salto, questo frammento di DNA neo sintetizzato va a legarsi per complementarietà alla sequenza DR1 presente all'estremità 3' della catena negativa, si chiude il cerchio e può partire a questo punto la sintesi della catena positiva, che però non viene completata, perché? Per capire perché non viene completata dobbiamo pensare che il tutto avviene all'interno delle proteine del core. Tutto questo processo avviene all'interno delle proteine del core e man mano che avviene il processo di retrotrascrizione va anche avanti il processo di morfogenesi. Qui sta avvenendo il processo di retrotrascrizione, il core raggiunge il reticolo endoplasmatico dove sono state inserite le 3 proteine L, M ed S e poi dal reticolo endoplasmatico e dal Golgi finalmente arriverà in ambiente cellulare. Cosa succede quando le proteine del core si chiudono? Precursori per completare la catena + vengono a mancare all'interno del core, gli mancano i precursori ed ecco che la sintesi della catena positiva si arresta.

Qualcuno chiede di ripetere: noi abbiamo delle sequenze direttamente ripetute che svolgono in questo processo duplicativo un ruolo fondamentale, la polimerasi si lega ad epsilon e copia DR1 presente sul RNA, lo stampo è un RNA a polarità + , quindi quella che stiamo sintetizzando è la catena di DNA negativa, viene sintetizzato un corto frammento di DNA che copia il DR1 a questo punto si ha un salto. Se noi torniamo a guardare l'RNA questa sequenza DR1 è ripetuta identica anche all'estremità opposta, quindi questo DNA neo sintetizzato portandosi dietro la polimerasi può fare un salto e andare per complementarietà a legarsi al DR1 all'estremità opposta, ecco che a partire da questo punto la polimerasi può incominciare, ovviamente in direzione 5'-3' a copiare tutto lo stampo di RNA e vedete qui come si allunga e si forma la catena di DNA negativa. Man mano che fa questo la trascrittasi inversa, lo abbiamo già detto più volte, è dotata di attività di RNasi H e l'RNA stampo (vedete qui tratteggiato) man mano che lo copia lo distrugge. L'RNA stampo viene completamente degradato ad eccezione di un corto frammento rappresentato dal CAP, quindi una corta sequenza di RNA e una corta sequenza DR1. Adesso un altro salto, questo DR1 per complementarietà va a legarsi alla sequenza DR2 all'estremità opposta, questa è la catena (indicata in arancione) di DNA – neosinteitzzata. Che cosa avrà? Una DR1 ad una estremità, e all'estremità opposta una DR1 e una DR2. Dell'RNA rimasto un pezzettino piccolino, CAP più DR1, ecco che questo DR1 per complementarietà può spostarsi e legarsi con il DR2 della catena meno. Ancora una volta siamo.. di dare avvio alla sintesi di DNA, si è legato al DR2, copia il DR1, quindi CAP-DR1-DR1 che fa un altro salto (l'ultimo) e va a legarsi al DR1 dell'estremità N-terminale della catena negativa.

Dove avviene questo? All'interno del core, che poi migra a livello del RE, in queste membrane sono state inserite le 3 proteine superficiali. Ecco questo è nel nucleo, si è formato il core dove sta avvenendo il processo di retrotrascrizione, dopodiché gemma nel reticolo endoplasmatico ed ecco qui una particella virale completa. Cosa avviene a livello del RE? Si formano anche delle particelle, sulla membrane del reticolo si sono depositate le proteine di superficie ecco che gemmano a livello del RE e del Golgi non soltanto delle particelle complete che possiedono un core con il genoma, ma gemmano anche delle particelle vuote. Particelle vuote sia sferiche che filamentose, in queste particelle troviamo due proteine superficiali la S e la M. Perché non troviamo la L? Verosimilmente perché la proteina L ostacola la liberazione di queste particelle dal RE. Quindi particelle sferiche e filamentose che hanno la stessa struttura antigenica delle particelle complete perché contengono la proteina M e la proteina S.
Finalmente arriviamo ad avere particelle virali liberate in ambiente extracellulare. Vi ricordo ancora una volta che per ognuna di queste particelle di HBV complete vengono liberate 1000 particelle sferiche vuote non infettanti.

Come viene trasmesso questo virus?

Innanzitutto importante è la via dalla madre al feto, è molto probabile che una persona siero positiva per l'HBV trasmetta alla progenie questa infezione. Alcune modalità di infezione sono dirette, come la trasmissione sessuale: molto frequente questo tipo di infezione tra persone omosessuali, prostitute e persone che hanno molteplici partner. Altra possibilità è la trasmissione parenterale, chi sarà a rischio? I drogati che fanno uso di droghe che vengono iniettate, oppure molte persone come dentisti, chirurghi, personale infermieristico che sono esposte per motivi di lavoro.
Trasfusioni, interventi chirurgici ecc... Trasmissione percutanea. Abbiamo anche una trasmissione diretta, molto importante è la trasmissione verticale che si ritiene essere come vi dicevo all'inizio, la via naturale scelta da questo virus per trasmettersi: infetta un individuo, cronicizza in questo individuo, proprio perché il virus ha cronicizzato (dura per molti anni), questa madre arriverà a trasmettere l'infezione al neonato.

3200 nucleotidi, una delle infezioni virali più gravi che noi conosciamo. L'OMS stima che ben 2 miliardi di uomini in tutto il mondo siano stati esposti all'HBV e che ben 400 milioni di persone siano carrier di questa infezione virale. Si contano circa un milione di morti dovute all'infezione da HBV, molti di questi morti sono bambini, e come vedremo in una successiva diapositiva la possibilità che il virus cronicizzi è molto ma molto maggiore se contratta da un neonato e non ha la possibilità quando l'infezione viene contratta in età adulta.
Questo scenario nei prossimi anni per fortuna dovrebbe cambiare, perché oggi abbiamo a disposizione un vaccino.
In questa figura vi sono dati epidemiologici, l'HBV risultava la nona causa di morte in tutto il mondo. 

 

La risposta immunitaria all'epatite B

E torniamo al nostro schema, abbiamo visto come replica, vediamo adesso come si difende dalle difese dell'ospite. Vi ho già detto prima è un virus piuttosto gentile, replica, produce particelle che escono in ambiente extracellulare senza danneggiare la cellula; mancano detriti quindi il sistema immunitario di tipo innato va un po' a rilento, il virus ne approfitta per avere più tempo per andare incontro al proprio ciclo replicativo. Non è un virus che induce interferon. Chi è che trova una giustificazione? Abbiamo fatto altri esempi, ad es. l'adeno, altro virus a DNA che abbiamo esaminato e vi ho detto che è un produttore di interferon. Qual è la catena che viene trascritta nell'HBV? La catena negativa, non si formeranno pertanto RNA messaggeri tra loro complementari come abbiamo visto nel caso degli adeno. Nel caso degli adeno il tratto del DNA, entrambe le catene venivano trascritte e si formavano RNA tra loro complementari. Non è il caso dell'HBV.
Basta un contatto tra il virus con envelope e la cellula ospite per far partire un segnale che culmina nella produzione di interferon. Quindi virus che hanno un envelope possono, semplicemente a contatto con la cellula ospite, indurre interferon. Però l'HBV nonostante abbia l'envelope non induce interferon. Questo vuol dire che oltre all'envelope è anche importante il contenuto proteico presente in quell'envelope.
Quindi non uccide la cellula, non induce interferon, però c'è un'altra arma che forse è la più sofisticata, che cosa se ne fa di tutte quelle particelle sferiche che in numero enorme vengono eliminate dalla cellula infettata? Le usa come un'esca. Vi ho detto che l'immunità innata tarda a capire che c'è un'infezione a livello epatico, però ad un certo punto qualche cellula epatica muore, finalmente il sistema immunitario innato si accorge che c'è qualcosa che non va bene e finalmente grazie all'intervento delle cellule dendritiche questa informazione viene riportata nel più vicino linfonodo e finalmente avremo l'attivazione di cellule B e di cellule T specifiche contro il virus HBV.
Cosa si è pensato il virus? Se trovo anticorpi che mi neutralizzano non posso più legarmi all'epatocita e viene bloccata la mia replicazione. Chi è che svia la risposta anticorpale? Le particelle vuote. Queste particelle hanno la stessa struttura antigenica delle particelle complete ed ecco che presenti in numero enormemente superiore rispetto alle particelle virali saranno preferibilmente il bersaglio degli anticorpi. Ecco che servono al virus per guadagnare tempo. 

Inoltre il virus prodotto nelle cellule epatiche viene riversato nel circolo ematico, con il circolo ematico ritorna al fegato e ha la possibilità di infettare altri epatociti. Quindi l'introduzione di particelle vuote, un mezzo che usa il virus per eludere la risposta anticorpale. La difesa a questo punto è tutta caricata sulle cellule T, sia sulle Tc che sulle Th1 infiammatorie. Il fatto che il virus dal sangue possa ritornare al fegato, fa si che molte cellule epatiche siano infettate. Vi ho detto un minuto fa è la risposta cellulo-mediata quella che deve intervenire, e il danno epatico paradossalmente è proprio legato all'intervento delle cellule Tc e dalle Th1 che provocano infiammazione. In altre parole, la lesione a livello epatico non è generata dalla replicazione del virus, ma dalla marcata risposta cellulo-mediata rivolta verso le cellule infettate. Per fortuna nonostante il ritardo e nonostante il ruolo principale svolto dalle cellule Tc nel 90% dei casi il nostro organismo con una valida risposta immunitaria riesce ad eradicare l'infezione e l'individuo non si accorge neanche di aver avuto questa infezione virale. Disgraziatamente però abbiamo un altro 30% in cui l'infezione si manifesta con i classici segni di una infezione a livello epatico, presenza di ittero, urine colorate, ... scuro, incremento delle transaminasi a testimonianza del danno epatico, dolore a livello epatico, nausea, vomito e così via... però in questo diciamo 30% per fortuna un 90% ancora una volta il sistema immunitario riesce, come dire, ad uscirne vincitore e questi individui guariscono eradicando completamente l'infezione è solo in un 10% che l'infezione diventa cronica, cosa vuol dire cronica? Vuol dire che ha vinto il virus, è un'infezione cronica che può durare per molti anni e sembrerebbe proprio per questo motivo che il virus abbia scelto la trasmissione materno fetale per assicurarsi una via naturale che gli consente di trasferirsi da un individuo ad un altro.
Guardando più, diciamo, schematizzato, queste ultime diapositive come si realizza il processo patogenetico dell'HBV, il virus entra per via ematica va nel fegato e si replica, produce particelle infettanti complete e particelle vuote. Dal fegato queste particelle vengono riversate nel sangue e dal sangue possono ritornare al fegato...altri cicli replicativi. Durante le prime settimane d'infezione come risultato della morte... minor percentuale di cellule infette, finalmente il sistema intanto si accorge che il fegato è danneggiato, si ha produzione di citochine, possibilità grazie alle cellule dendritiche di comunicare con i linfonodi e quindi come conseguenza produzione di anticorpi specifici e attivazione delle cellule Tc. 

 
Nel 70% degli individui adulti il virus è eradicato senza aver manifestato nessuno o pochi sintomi; nella restante percentuale ecco che le cellule epatiche, mediata direttamente dalle cellule Tc e il danno infiammatorio provocato dalle Th1 causano comparsa di sintomi e testimoniano il danneggiamento a livello epatico. Anche in questo caso però in una elevata percentuale di soggetti arriviamo ad una eradicazione dell'infezione totale e la sua risoluzione, solo in una minima percentuale degli individui, 10% l'HBV vince la battaglia e si stabilisce una infezione cronica, non è che il sistema immunitario rimanga addormentato, continua a rispondere, certe volte naturalmente la carica virale scende ma non riesce ad eradicarlo, i virus che rimangono riprendono a replicarsi, e quali sono le conseguenze.. può evolvere in cirrosi, come pure può, diciamo un 20%, manifestarsi un cancro a livello epatico. 

 
A che cosa è legata la possibilità dell'HBV di provocare un carcinoma epatico, nessun virus fino ad oggi è conosciuto come unico responsabile della insorgenza di un tumore, più che altro si parla di anelli di una catena, che diciamo, tutti concorrono nel risultato finale che è quello di una formazione di un tumore. Quando il virus dell'epatite C cresce nelle cellule epatiche abbiamo visto che è forte il danno a livello epatico legato alla risposta cellulo-mediata. Le cellule del fegato però, e questo lo sapete, sono cellule che possono rigenerarsi, se una porzione di fegato è distrutta le cellule epatiche replicarsi e sostituire la parte che è andata perduta e si trovano oltre che essere infettate dall'HBV sono anche cellule indotte a replicarsi. Qual è la funzione normale del fegato? È l'organo deputato al processo di detossificazione. In particolare vediamo l'importanza di detossificare l'organismo da prodotti genotossici. In un fegato sano arrivano questi prodotti genotossici, sono cellule quiescenti, il composto genotossico fa il suo danno però la cellula è capace di riparare questi danni, diciamo non ha grosse conseguenze. Diverso è il fatto di quando l'esposizione di questi prodotti genotossici avviene in cellule epatiche che per rimpiazzare quelle morte sono in attiva fase replicativa, il tempo per riparare i danni non c'è, la cellula replica e questa fretta comporta l'insorgenza di mutazioni che sono ritenute responsabili dell'insorgenza di un epatocarcinoma.
Non meno importante si ritiene la proteina X, è una proteina in grado di sequestrare la p53, può bloccare l'apoptosi mediata da TNF, come pure è in grado di iper regolare diverse chinasi che sono implicate nella trasmissione del segnale dalla superficie al nucleo cellulare. 

 
Per quanto riguarda la terapia dell'HBV, fino a qualche anno fa era affidata all'interferon peghilato che era in grado di stimolare le difese dell'ospite e oggi abbiamo anche a disposizione degli analoghi strutturali e tra questi il primo è stato la Lamivudina che è un analogo della deossicitidina. È stato scoperto prima per l'HIV e poi si è visto che era in grado di ostacolare anche l'azione dell'HBV.
Cosa vuol dire analogo strutturale? Struttura simile fino ad un certo punto, in cosa differisce? La presenza di uno zolfo al posto di un gruppo OH, dove si lega la polimerasi, una volta che questo composto nella cellula è trifosforilato la DNA polimerasi della cellula quando sta sintetizzando DNA, siccome è un enzima molto accurato, non si fa ingannare, dice tu non sei deossicitidina, io capisco che tu hai uno zolfo in questa posizione, ti manca l'OH.
Cosa succede invece se quella cellula è infettata da HBV, verrà ovviamente convertito in trifosfato, gli analoghi glucosidici per funzionare devono essere attivati, la trascrittasi inversa virale dell'HBV sta sintetizzando il DNA virale si lascia ingannare, scambia questa per una citidina trifosfato e la incorpora nel proprio DNA. Qual è la conseguenza? La conseguenza è che fungerà da terminatore di catena, perché manca l'ossidrile in questa posizione, in 3', che è indispensabile perché una volta che questo analogo è stato inserito nel DNA nascente funge da terminatore di catena, arresto della sintesi. 

 
Come dicevo prima abbiamo a disposizione un vaccino. Qualche anno fa quale principio vaccinante si utilizzava? Sangue di un paziente che aveva una infezione, si allontanavano le particelle virali complete e rimanevano le particelle vuote non infettanti, però capite bene che è un vaccino veramente a rischio. Per fortuna oggi abbiamo, grazie alle tecniche del DNA ricombinante, la possibilità di un vaccino sicuro. L'antigene di superficie viene clonato, questo gene S clonato viene inserito nel lievito, ecco come cresce il lievito cresce e produce l'antigene di superficie che viene purificato e può essere utilizzato come principio vaccinante, quindi una sola porzione del virus viene utilizzata in questo vaccino ed ovviamente è un vaccino estremamente sicuro. Vi dicevo all'inizio che l'ospite di questo virus è l'uomo, e possiamo pensare alla eradicazione dell'HBV.