Herpes simplex 1 e 2

C'è un virus che in seguito a mutazioni non induce più timidino chinasi, non è più in grado di fosforilare la timidina. Poi abbiamo un virus erpetico che invece non ha questa mutazione. Se io prendo questo virus che ho mutato nella timidino chinasi, ho delle colture cellulari suscettibili all'infezione con Herpes, le infetto secondo voi questo virus timidino chinasi meno, in queste colture cellulari sane che duplicano bene il proprio DNA cellulare, il virus cresce? Si, perché la cellula gli presta tutto il pool che gli serve. Io prendo e vado ad inoculare il virus nella coltura cellulare, apparentemente dico che quella mutazione non ha nessun effetto perché il virus nonostante tutto nella coltura cellulare cresce bene. Ma noi dobbiamo tener conto del fatto che quando noi infettiamo una cellula con un virus, al virus lo facciamo vivere benissimo, perché è tutto sterile, le cellule sono suscettibili alla sua infezione, il terreno ha la quantità di siero perfetta, ma cosa succede se io questo virus timidino chinasi meno lo inoculo in un animale? Questo virus cresce a stento e soprattutto, è destinato ad estinguersi, perché, anche supponendo che riesca a raggiungere il ganglio nervoso in cui instaurare latenza, potrà riattivarsi? No, perché le cellule nervose sono cellule differenziate che hanno messo a tacere tutto il macchinario della replicazione, il virus non può chiedergli aiuto, quando si vuole riattivare per dare luogo ad una manifestazione clinica apparente, deve avere necessariamente a disposizione perché codificato dal proprio genoma, tutto quello che gli serve per riprendere ad esprimersi e per arrivare alla formazione di particella virali neoformate infettanti.
Ed ecco, deve prepararsi dei precursori per la sintesi del DNA e deve avere a disposizione delle proteine per duplicare, deve avere  la capacità di sintetizzare proteine virali per duplicare questo genoma. Schematicamente vediamo come avviene all'inizio la replicazione del genoma erpetico, è una duplicazione bidirezionale, sono presenti diversi siti di origine, la prima proteina che interviene nel processo di duplicazione è la proteina UL9 che si lega ad una origine. Si ha poi srotolamento sempre da parte di UL9 della catena a doppio filamento e il filamento singolo così prodotto viene ricoperto dalla proteina ICP8 che si lega al DNA monocatenario. Intervengono poi una serie di proteine che formano un complesso, sono le proteine UL5, UL8 e UL52, anche loro hanno attività di elicasi, di srotolamento del DNA, ma la funzione fondamentale è quella di sintetizzare un primer, come tutte le DNA polimerasi DNA-dipendenti è un enzima che ha bisogno di un innesco, e queste tre proteine concorrono alla sua sintesi. Finalmente la proteina principale, UL30 (ricordiamo che la sigla UL o US sta per sequenza unica lunga o corta), la polimerasi, comincia con meccanismo bidirezionale a copiare la molecola di DNA. All'inizio questa replicazione è bidirezionale, ad un certo punto, con un meccanismo non ancora chiarito, cessa di essere bidirezionale e diventa una replicazione secondo il modello del circolo rotante. Cosa vuol dire? Il DNA circolare bicatenario viene tagliato in una delle due catene,  ecco che da questo punto, una catena è stata aperta, mentre la catena complementare rimane integra e funge da stampo. Da questo punto dove il DNA è stato clivato, la DNA polimerasi insieme con un fattore, la polimerasi è questo cerchietto celeste mentre il più scuro è la proteina 42 che facilita il progredire della polimerasi sullo stampo. Come la polimerasi procede trova l'estremità del DNA della stessa catena, l'ha aperta quindi quando si sposta scontra con l'estremità della stessa catena e quando la incontra la distacca dal DNA stampo e procede nella sintesi. In parole povere la catena verde viene spiazzata dalla sua posizione per diventare un singolo filamento. A questo punto abbiamo la catena integra che funge da stampo mentre l'altra viene srotolata, e man mano che questo avviene, sempre ad opera della polimerasi UL30 ed il fattore che facilita il procedere della polimerasi, copiano questa catena dislocata, e quale sarà il risultato? La formazione di un lungo concatenamero. Probabilmente perché fa questo? Perché è più veloce il fatto che, nonostante una delle due catene funga da stampo, che si realizzino tanti genomi che rimangono legati gli uni con gli altri. Da una parte circolo rotante, duplicazione che determina la formazione di tanti genomi, dall'altra abbiamo che su questi DNA neo sintetizzati si formano dei trascritti che poi portano alla sintesi delle proteine strutturali. 

Come procede il processo di morfogenesi di una proteina? Sei proteine strutturali, delle quali  la principale è VP5, formano il capside icosaedrico. Come lo formano? Lo formano intorno ad un' impalcatura formata da altre proteine virali che sono la VP21, 22 e 24.In altre parole, delle proteine virali formano un'impalcatura, altre proteine, tra cui la principale VP5 intorno a questa struttura proteica costituiscono un capside icosaedrico. Ecco che altre attività enzimatiche, sempre virali, riconoscono l'inizio e la fine di un genoma, ne facilitano l'ingresso all'interno del capside in via di formazione e mentre questo avviene, le proteine dell'impalcatura vengono riversate all'esterno del capside e alla fine si avrà un taglio della lunghezza esatta del genoma, che pertanto si viene a trovare all'interno del capside come molecola di DNA bicatenario lineare, non è più circolarizzato o determinato da un concatenamero. A questo punto cosa manca? 

Abbiamo visto come si sintetizza un capside, alla fine di questo processo si chiude poiché contiene l'intera informazione genomica del DNA. Per completare la formazione di una particella virale ci manca da vedere come viene sintetizzato l'envelope. Le teorie sulla formazione dell'envelope sono tre, e tutte e tre sono rappresentate nella diapositiva. Nella parte bassa, questa è la membrana nucleare con il suo foglietto esterno rivolto verso il citoplasma, ed un foglietto interno. Secondo il primo modello di morfogenesi, il nucleo-capside si è formato nel nucleo e acquisisce il proprio envelope dove sono state inserite proteine virali, a livello del foglietto interno della membrana nucleare. Si introflette il foglietto esterno della membrana nucleare e si forma una particella virale completa: genoma, capside ed envelope. Questo virus lascia la membrana nucleare gemmando dal foglietto esterno di questa, così facendo acquisisce un ulteriore rivestimento, e quella che chiamiamo una vescicola secretoria migra poi nel Golgi, e con l'intervento di questo organulo la membrana più esterna si fonde con quella della membrana citoplasmatica ed una particella completa dotata di envelope sarà riversata nell'ambiente extacellulare. Secondo il secondo modello acquisisce l'envelope a livello del foglietto interno della membrana nucleare ma poi fuoriuscendo dal foglietto esterno perde l'envelope e lo acquisisce a livello della membrana del Golgi, dove le proteine virali, lungo il processo di morfogenesi, sono state inserite. Anche in questo caso si ha la formazione di una vescicola secretoria, la membrana più esterna si fonde con la membrana citoplasmatica. Anche quest'altro modello consente la liberazione di particelle virali infettanti in ambiente extracellulare. Acquisisce l'envelope nel foglietto interno della membrana nucleare, si forma quindi una particella virale completa che si fonde poi con il foglietto esterno della membrana nucleare ed il virus che ha così acquisito un corpo esterno lo perde immediatamente e lo riacquisisce poi a livello del Golgi. Anche in questo caso si forma una vescicola secretoria che si fonde con la membrana plasmatica per la liberazione in ambiente cellulare. Nel terzo modello si è visto che i pori della membrana nucleare sono di sufficiente grandezza per consentire il passaggio diretto di un nucleo capside. In questo caso nessun acquisto di envelope a livello della membrana nucleare, ma questo nucleo capside neo sintetizzato migra immediatamente nel citoplasma e acquisisce un primo ed ultimo envelope a livello dell'apparato del Golgi per seguire poi lo stesso destino esaminato nei due modelli precedenti. Diciamo che comunque non si sa ancora ciò che accade realmente nella cellula che viene infettata. Siamo così arrivati a particelle complete ed infettanti. 

Vediamo ora un aspetto molto importante: molti geni aiutano l'Herpes a difendersi da quelle che sono le difese dell'ospite. Primo fra tutti il meccanismo di latenza, andare a nascondersi in forma episomiale nel nucleo di una cellula nervosa consente al virus sia di sottrarsi alla risposta umorale che alla risposta cellulo-mediata. Purtroppo ciò non è vero solo per la latenza degli Herpes, per tutti i virus che stanno in latenza questo è uno degli aspetti della replicazione virale che ancora sono poco chiari, come il virus riesce ad instaurare latenza nei dettagli non lo sappiamo ancora. Una spiegazione per quanto riguarda l'Herpes può essere questa: il virus per potersi esprimere deve portarsi dietro la proteina VP16 del tegumento, poiché gli consente di trascrivere i geni precoci immediati. Questa proteina consentiva appunto alla polimerasi II della cellula di avviare la trascrizione dei primi messaggeri virali. Cosa succede? Qui siamo in fase di manifestazione clinica, le cellule dell'epitelio, produzione di particelle virali. Alla terminazione di un assone la particella virale penetra  e per arrivare al nucleo di questa cellula che è piuttosto distante, il virus si muove percorrendo tutto l'assone. È possibile che lungo questo tragitto, quando è penetrato nella cellula nervosa il virus ha iniziato la sua svestizione andando incontro ad uncoating, poche molecole di VP16 sono state liberate in questa zona terminale dell'assone. Man mano che il virus progredisce, poiché la strada è molto lunga, molecole di VP16 possono non raggiungere il nucleo. L'assone è lungo, quando la particella virale penetra in questa cellula, sottostà all'uncoating ed alcune proteine del tegumento, tra cui fondamentale la VP16 devono arrivare al nucleo affinché il dna virale possa essere trascritto e dato che la strada da percorrere è lunga, le proteine VP16 non riescono ad arrivare al nucleo e questo spiega perché il virus diventa silente. Abbiamo visto anche che il virus circolarizza, non si integra nel cromosoma dell'ospite ma rimane sotto forma di episoma e non si esprime, fatta eccezione per il trascritto LAT che è quello associato alla latenza. Questo trascritto si forma, non sappiamo ancora la funzione ma sappiamo che stranamente è formato da introni. Sapete che dopo lo splicing gli esoni si legano tra di loro per formare un mRNA maturo che verrà tradotto, qui troviamo questi trascritti formati da introni dei quali non conosciamo ancora la funzione. Si chiama in causa una loro possibile complementarietà a messaggeri virali che li legano bloccandone l'espressione, ma non siamo ancora sicuri che questa sia la loro funzione. Quello che si sa è che in seguito a vari stimoli questo episoma può essere il punto di partenza per la formazione di una progenie virale. Quindi una difesa enorme contro gli attacchi immunitari nelle cellule T, perché la membrana citoplasmatica di questa cellula non è alterata visto che il virus non si esprime, non riconoscono questa cellula come affetta, tanto meno gli anticorpi prodotti contro l'Herpes possono entrare all'interno della cellula, quindi il sistema immunitario è privo di armi contro la latenza, sicuramente il meccanismo di difesa migliore, ma non è l'unico. Il virus ha bisogno di tempo per la sua replicazione ed ecco che il virus ha tre proteine virali che bloccano l'apoptosi della cellula, il virus non vuole uccidere subito la cellula perché necessità di tempo per la sua replicazione, poiché per tutto il tempo necessario alla replicazione e duplicazione la cellula deve essere sana. Inoltre abbiamo una proteina virale che blocca lo splicing dell'mRNA, mettendo fine ai messaggeri precoci primari, consentendo così al virus una regolazione temporale, mentre nel nucleo, inibendo lo splicing, consente di dare un blocco a quelle che sono le sintesi delle macromolecolari cellulari. Abbiamo visto la VHS che spezzettava i messaggeri nel citoplasma, non basta, nel nucleo i messaggeri cellulari, che per essere funzionale devono essere sottoposti a splicing, non lo possono essere perché c'è la proteina ICP27 che inibisce lo splicing dell'mRNA. Inoltre, sia l'inibizione dello splicing, sia il fatto che una proteina virale, la VHS, degradi i messaggeri, rende impossibile la produzione di interferon. Quando una cellula è infettata da un virus risponde attivando dei geni i quali vengono trascritti con produzione di interferon che poi sarà riversato in ambiente extracellulare per andare ad avvisare le cellule vicine. È chiaro che se è presente una proteina virale come la ICP27 ed un'altra la VHS che degrada gli mRNA cellulari, questa cellula non avrà la possibilità di arrivare alla sintesi di interferon e alla sua secrezione in ambiente cellulare. 

Altra difesa della cellula infettata è quella di avvisare il sistema immunocompetente della presenza di un virus in replicazione nel suo interno. Come vanno normalmente le cose? Le proteine virali a livello dei proteasomi vengono spezzettate e ridotte in singoli antigeni, ogni singolo peptide, dopo questo processamento, attraverso questo canalicolo chiamato TAP, penetra nel reticolo endoplasmatico dove viene legato alle MHC1. Perché è determinante? Questa è l'esposizione dell'antigene, che potrà, solo dopo essere legato ad una molecola di  MHC1 essere riconosciuto da una cellula T citotossica che a questo punto prenderà contatto sia con l'antigene, con l'MHC1. Si accorgerà così che l'antigene è estraneo e rilascerà perforine e granzimi che indirizzeranno la cellula in apoptosi. Cos'ha organizzato il virus con la sua ICP47? Dato che la cellula è evoluta in una maniera sofisticata, produce una proteina virale che andrà a legarsi ad MHC1 che la esporrà in superficie per richiamare in aiuto le cellule T citotossiche. Ecco che ICP47 interviene tappando questo TAP, impedendo così ai peptidi virali di raggiungere il loro reticolo endoplasmatico, non potranno così essere legate alle proteine MHC1, e si difendono così dall'intervento delle cellule T citotossiche e recupera così tempo per portare avanti il suo ciclo replicativo. 

Abbiamo visto la latenza, la capacità di bloccare la produzione di interferon, la capacità di bloccare la presentazione dell'antigene impedendo l'ingresso nel reticolo endoplasmatico. Altra tecnica che determina l'evasione dalle difese dell'ospite, l'intervento della proteina ICP345. Una cellula attivata dall'interferon produce la forma inattiva della PKR, quando questa cellula che è stata avvisata dall'interferon è infettata, grazie alla presenza del virus si formerà DNA bicatenario, che andrà ad attivare la PKR e l'effetto ultimo sarà quello di bloccare la sintesi proteica tramite fosforilazione del fattore EIF2. Il virus si è fatto furbo e dice, tu blocchi la sintesi proteica fosforilando il fattore EIF2 e impedendo così il procedere del ciclo che porta al complesso che porta all'inizio della sintesi proteica ed ecco che io mi procuro una proteina, ICP345,che è in grado di defosforilare il fattore EIF2 in modo che il circolo possa riprendere secondo quella che è la normale strada di funzionamento. Quindi defosforilazione del fattore EIF2 e possibilità per la cellula di andare avanti con la sintesi proteica ed il virus ne può approfittare per sintetizzare le proprie proteine.

Abbiamo a disposizione un farmaco che ha segnato il successo della chemioterapia antivirale, non è una cura poiché non è un farmaco in grado di porre fine alla latenza, ha però indiscussi vantaggi clinici, diminuisce i tempi di guarigione e come cura in molti casi rallenta il periodo di tempo di fenomeni ricorrenti. Il farmaco è l'aciclovir, è un analogo nucleotidico, aciclico della guanosina attivo soprattutto contro l'HSV1, due volte meno attivo contro il simplex 2 e dieci volte meno attivo nei riguardi del virus della varicella o contro il virus di Epstein barr. Cosa vuol dire analogo glucosidico della deossiguanosina? Questo è il composto naturale deossiguanosina la base purinica legata ad uno zucchero, fondamentale in questo zucchero la presenza di un gruppo ossidrile in posizione 3'. L'acicloguanosina è identica rispetto alla deossiguanosina per quanto riguarda la costituzione della porzione purinica, però al posto dello zucchero ciclico chiuso è presente una catena laterale aperta. Cosa succede? All'inizio si è visto che era attivo nell'inibire in vivo in laboratorio colture cellulari la replicazione dell'Herpes, vi furono grandi sorprese quando venne scoperto il meccanismo d'azione. Questa acicloguanosina, sapete che la deossiguanosina per partecipare alla sintesi del dna  dev'essere convertita nella forma trifosfato. Si è visto che l'acicloguanosina pur essendo un analogo strutturale purinico viene riconosciuto dalla timidino chinasi virale. Vi ricordate? Il virus si rende autonomo nella propria replicazione virale, tra le varie proteine enzimatiche che sintetizza c'è una timidino chinasi. Dev'essere autonomo perché la sua riattivazione avviene nelle cellule nervose. Gli enzimi virali rispetto a quelli cellulari sono molto più (1.25.36?),cosa succede quando in una cellula infettata dal virus entra l'aciclovir? La molecola come tale è inattiva, per diventare attiva deve essere convertita in mono, di e trifosfato, chi è capace di realizzare questo primo passaggio dell'attivazione? La timidino chinasi cellulare, quindi in una cellula in cui timidina non ce n'è, dice tu sei un analogo strutturale ed io ti scarto, quindi la cellula non infettata non metabolizza l'aciclovir. Cosa succede invece quando questo composto entra in una cellula infettata? Trova una timidino chinasi virale che è talmente sconclusionata ed inaccurata nella sua modalità d'azione che non riconosce questo come un analogo fraudolento e riesce a fosforilarlo. Nella cellula non infetta l'aciclovir rimane non metabolizzato, nessuna attività enzimatica si fa ingannare convertendolo nella forma monofosfato. 

Diversa invece la situazione quando una cellula è infettata, essere infettata da Herpes Simplex vuol dire avere una timidino chinasi virale che si fa ingannare e attacca un gruppo fosfato all'aciclovir. Attività enzimatiche chinasiche cellulari, una volta che il primo gruppo fosfato è stato aggiunto, convertono l'acicloguanosina nella forma bifosfato. A questo punto è avvenuta la completa attivazione dell'aciclovir, siamo arrivati ad avere aciclovir trifosfato. La DNA polimerasi DNA dipendente virale quando sta sintetizzando il dna (stiamo parlando del DNA virale) è anche lei un'attività enzimatica non molto precisa nel suo funzionamento, quando trova un C anziché accoppiare correttamente un GTP, desossiGTP, si fa ingannare, non capisce che ACG-trifosfato è un analogo fraudolento a cui manca completamente lo zucchero e che ha solo una catena laterale. Lo lega e per complementarietà lo lega a C, questo è possibile perché l'ACG è stato fosforilato solo nelle cellule infettate da Herpes dove è presente una timidino chinasi virale, una volta che siamo arrivati al completamento dell'attivazione dell'ACG ad AGC-trifosfato la dna polimerasi dna dipendente virale lo cattura, fa confusione poiché non capisce che non è un deossi –GTP-trifosfato e così quando si sta sintetizzando il dna virale lo incorpora. Perché questa incorporazione mette fine alla duplicazione del dna virale? Perché manca lo zucchero, è una catena laterale in cui è assente il gruppo –OH ,si forma così un complesso inattivo, la polimerasi non può andare avanti nella duplicazione del dna perché manca quell'-OH fondamentale, ha bisogno di un innesco per legare per complementarietà il successivo desossiribonucleotide.