Citogenetica:

 
 
 
Citogenetica
di Domenico Azarnia Tehran
 
Appunti del corso di citogenetica che esplorano le caratteristiche dei
cromosomi e le loro possibili alterazioni nelle fasi di duplicazione cellulare. Si
descrivono i siti fragili del cariotipo umano e le sindromi associate alle
mutazioni geniche che interessano mitosi e meiosi.
 
Università: Università degli Studi di Roma La Sapienza
Facoltà: Scienze Matematiche, Fisiche e Naturali
Corso: Scienze Biologiche
Esame: Citogenetica
Docente: Franca Pelliccia1. I costituenti del cromosoma lineare degli eucarioti 
I principali costituenti del cromosoma lineare degli eucarioti sono: il centromero (detto anche costrizione
primaria), costrizione secondaria o regione dell'organizzatore nucleolare (NOR) e il telomero (le parti
terminali del cromosoma). Esiste un'altra componente costitutiva dei cromosomi, soprattutto nei cromosomi
di mammifero ma è stata trovata anche in altri organismi, simili alle costrizioni secondarie che vengono
chiamate siti fragili.  Come sappiamo, durante la mitosi, i cromatidi fratelli si spostano a poli opposti della
cellula e il loro movimento dipende dall'attacco del cromosoma ai microtubuli, che sono connessi all'altra
estremità ai poli. I siti nelle due regioni in cui sono organizzate le estremità dei microtubuli, in vicinanza dei
centrioli ai poli e sui cromosomi, sono chiamate MTOC (microtuble organizing centers, centri di
organizzazione dei microtubuli). La regione del cromosoma che è responsabile della sua segregazione
durante la mitosi e la meiosi si chiama centromero. La regione centromerica di ciascun cromatide fratello è
tirata dai microtubuli a poli opposti. Opponendosi a questa forza motrice, proteine “colla” chiamate coesine,
tengono uniti i cromatidi fratelli che, inizialmente, si separano a livello dei centromeri e quindi sono
rilasciati completamente l'uno dall'altro durante l'anafase quando le coesine vengono degradate. Il
centromero è essenziale per la segregazione, come dimostrato dal comportamento di cromosomi che sono
stati spezzati. Una singola rottura genera un pezzo che mantiene il centromero e un altro, un frammento
acentrico, che ne è privo. Il frammento acentrico non si attacca al fuso mitotico e non viene quindi incluso in
nessuno dei nuclei figli.  Le regioni che fiancheggiano il centromero sono spesso ricche di sequenze di DNA
satellite e possiedono una quantità considerevole di eterocromatina. Il DNA centromerico si lega a proteine
specifiche responsabili della costruzione della struttura che attacca il cromosoma ai microtubuli, che è
chiamata cinetocore ed è una zona fibrosa intensamente colorato con un diametro di 400 nm. Il cinetocore
rappresenta il MTOC di un cromosoma. In generale, quindi, nella regione centromerica c'è un dominio
centrale costituito dall'appaiamento dei cromatidi, poi c'è il domino di appaiamento con il cinetocore e il
dominio del cinetocore, a cui si attaccano le fibre del fuso. La posizione del centromero, inoltre, permette di
catalogare i cromosomi in  base alla loro forma in: metacentrico, costrizione primaria centrale, acrocentrico,
costrizione primaria ad un'estremità, telocentrico, costrizione primaria in corrispondenza del telomero,
submetacentrico, costrizione primaria quasi centrale e subtelocentrico, costrizione primaria quasi telomerica.
 
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Citogenetica 2. Le possibili segregazioni  in mitosi ed in meiosi
Come sappiamo, dopo la duplicazione del DNA, i cromosomi vanno in G2 e poi in mitosi. Nel primo evento
della mitosi sono fondamentali i microtubuli che si attaccano, una volta che si è formato il cinetocore, in
modo corretto alle fibre del fuso. Questo legame può avvenire in diversi modi: (1) nell'attacco sintelico: le
fibre del fuso non si attaccano ai lati opposti ma centralmente, come se fosse una meiosi, invece, 
nell'attacco melotelico, la principale quantità di fibre del fuso si attaccano ad un cromatidio e poche all'altro.
Entrambi i tipi non sono regolari, determinano una mal segregazione e risultano instabili. Per questo motivo,
esiste un meccanismo, mediato da una chinasi (Aurora B/lpl1 kinase), che controlla appunto l'attacco
corretto delle fibre del fuso. Se quest'ultimo risulta alterato, c'è un blocco e un azzeramento dell'attacco delle
fibre ad uno dei due cromatidi, in modo che si abbia un attacco monotelico, cioè su un solo cromatidio.
Dopo questo evento si ha l'attacco corretto che è anfitelico, ossia da tutte e due i cinetocori, in modo che ci
sia un bi-orientamento delle fibre del fuso attaccate ai cromatidi e quindi dei cromatidi stessi. Ci deve essere
quindi una tensione a livello della cromatina centromerica che determina un attacco stabile, in poche parole
una forza che spinge verso sinistra e un altra verso destra.  
I cromatidi, durante questo processo, essendo ancora abbastanza poco addensati vengono mantenuti uniti da
una serie di proteine. Ad esempio la topoisomerasi II lega insieme le proteine della coesina  alla fibra di
DNA. Nel corso della profase, da quella precoce a quella tardiva, parte della coesina viene degradata quindi
i cromatidi risultano più addensati con meno libertà di movimento in quanto  comunque alcuni legami, in cui
sono coinvolte sempre le coesine permangono, e solo all'inizio della prometafase avvengono i primi attacchi
delle fibre del fuso al cinetocore. A questo punto si possono avere varie errori di legame, ad esempio una
fibra invece di andare in direzione opposta e di creare una tensione va nella stessa direzione (quindi ne
risulta un non corretto orientamento) e per questo  esistono diversi sistemi di controllo i quali si attuano
nell'eliminazione di alcune fibre per determinare un corretto bi-orientamento delle fibre del fuso. Dopo di
che i cromosomi si mettono in piastra metafasica, si ha una completa degradazione della coesina, quindi si
rompe  il legame coesina-topoisomerasi II-DNA e i cromatidi sono liberi di muoversi. L'ultimo link che si
rompe è quello a livello del centromero.  
In maniera più dettagliata, si osserva che in profase i due cromatidi fratelli risultano essere legati dal
complesso della coesina-topoisomerasi II. Quest'ultimo ha un “modello ad anello” costituito da due proteine,
Smc3 e Smc1, e la proteina Scc1 che chiude la coesina (e quindi costituisce l'anello) e fa si che si leghi
insieme alla topoisomerasi II per tenere uniti i cromatidi fratelli. A questo punto un complesso costituito
dalla proteina securina e da un enzima denominato separasi, viene attivato provocando il taglio nella regione
centromerica e in questo modo i cromatidi sono liberi di  migrare ai poli opposti.  
Nella meiosi il meccanismo è molto simile anche se vi è una diversità non tanto nella classe di proteine ma
nella loro conformazione. Infatti vi è sempre la presenza della coesina però esiste un complesso diverso
denominato appunto complesso meiotico della coesina. In questo caso, i cromatidi fratelli sono legati in una
zona chiamata chiasma dove vi è ricombinazione tra i due cromosomi omologhi, ossia quello di origine
materna e quello di origine paterna (detti anche cromosomi bivalenti o tetradi, ciascuno fatto da due
cromatidi). A questo punto, nella prima metafase si vengono a formare i microtubuli e e fibre del fuso si
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Citogenetica attaccano in modo corretto, attuando una tensione in quanto le molecole di tubulina hanno una carica diversa
verso il centromero e verso il polo,  si ha attrazione elettrostatica e vi è repulsione tra le due fibre del fuso. Il
complesso securina-separasi è attivato dal complesso APC e la separasi attua il taglio con conseguente
distacco solo di alcune coesine, in quanto nella prima anafase meiotica si separano i cromosomi omologhi
ma il cromosoma rimane suddiviso nei due cromatidi. Quindi dal punto di vista del DNA i cromosomi sono
ancora 2c in quanto ciascun cromosoma è costituito da due molecole di DNA, per questo la divisione
meiotica non è ancora completa. Diventerà completa solo nella seconda divisione meiotica quando si ha
sempre la formazione delle fibre del fuso, l'attivazione della separasi e la formazione delle cellule germinali
con n come numero di cromosomi e c come molecole di DNA.
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Citogenetica 3. La struttura del centromero nei diversi organismi modello
Per molti anni, si è pensato, dato la struttura del centromero è comune a tutti le specie che hanno cromosomi
lineari, che questo fosse costituito da DNA omologo in tutti questi organismi. Invece, quello che si è
scoperto è che nonostante la funzione sia altamente conservata la morfologia della regione centromerica
varia in maniera sorprendente da specie a specie. Per esempio in Saccharomyces cerevisiae non esiste una
struttura visibile ossia non vi è la costrizione primaria. Nei nematodi, invece, i cromosomi sono olocentrici
cioè la regione centromerica è distribuita in tutto il cromosoma, ovvero non vi è una sola regione
centromerica, e i microtubuli si attaccano in diversi punti su tutto il cromosoma. Invece, in molte piante e
animali il centromero forma una costrizione primaria ben visibile in metafase e il cinetocore, in molti ma
non in tutti, consiste in una struttura che è ben distinta dal cromosoma e spesso è suddivisa in sotto regioni.
Quindi una prima importante divisione può essere fatta tra i cromosomi monocentrici, in cui una regione
particolare del centromero interagisce con i microtubuli  e quindi i cromosomi si muovono verso i poli in
anafase seguendo il centromero, e  i cromosomi olocentrici nei quali i microtubuli si legano lungo tutto il
cromosoma. In questo caso ancora non si è riuscito a capire se questi due modelli cromosomici
(monocentrico e olocentrico) hanno un origine convergente, ossia si sono evoluti insieme, oppure se il
modello olocentrico sia quello ancestrale. Comunque, negli organismi fin ora studiati, al centromero c'è una
proteina, insieme all'istone H3, che ha le caratteristiche di quest'ultimo ma non è H3 e viene chiamata per
questo CENP-A o CEN-H3. Quest'ultima si riscontra verso l'esterno della regione centromerica mentre
l'istone H3 verso l'interno; quindi bisogna immaginare il DNA centromerico legato a queste proteine.
Comunque, diversi studi suggeriscono che il centromero è la regione di DNA che assicura la stabilità
genetica ed è quindi di vitale importanza. Le proteine centromeriche e i domini strutturali, anche nei
cromosomi olocentrici, sono altamente conservati nonostante le sequenze di questo tipo di  DNA  siano
altamente variabili e non conservate. Si è visto , inoltre, che l'identità centromerica non è determinata dalle
sequenze di DNA ripetuto, ma esiste un controllo epigenetico (ossia qualsiasi cambiamento ereditabile a
livello dei cromosomi non imputabile ad un cambiamento avvenuto nella sequenza di DNA) che governa il
macchinario molecolare del centromero, come quello che controlla la messa insieme e la propagazione del
centromero (ossia come viene ereditato l'apparato che costituirà il centromero delle cellule figlie) dopo la
replicazione del DNA. Tutto questo è importante perché se vi sono aberrazioni o alterazioni del numero
cromosomico le cellule non sono più vitali.  
In generale, il centromero di un eucariote superiore può contenere da centinaia a migliaia di kilobasi di
sequenze di DNA ripetute in tandem. Queste sequenze però non sono responsabili dell'organizzazione del
centromero, infatti si è visto che in cromosomi umani isodicentrici, ossia con i due bracci cromosomici
uguali e due regioni centromeriche identiche, ma separate da DNA, hanno un solo  centromero attivo
dimostrando, appunto, che non è la sequenza di DNA la sola responsabile dell'organizzazione del
centromero ma per essere funzionale la costrizione primaria ha bisogna di altri meccanismi, come appunto
quello epigenetico. Inoltre, si è osservato che neocentromeri funzionali possono apparire ex novo a partire
da DNA non centromerico su cromosomi umani e di Drosophila melanogaster indicando che l'assemblaggio
del cinetocore può avvenire anche a carico di un numero di sequenze genomiche diverse da quelle
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Citogenetica prettamente centromeriche. Infine, quando è stato possibile sequenziare i genomi, si è visto che il satellite
minor, riscontrato nel topo, manca del centromero del cromosoma Y e quindi non è fondamentale per la
corretta segregazione. Per quanto riguarda i cromosomi umani, invece, si è visto che le regioni
centromeriche sono costituite da sequenze di DNA ripetuto in tandem, quindi numerosi ricercatori , per
approfondire le conoscenze su queste sequenze, hanno cercato di rompere il DNA cromosomico
centromerico del cromosoma Y, essendo il più piccolo e di facile manipolazione. Per fare questo si è usato il
DNA telomerico che è costituito da sequenze ripetute con l'ordine TTAGG. Queste sequenze si trovano
all'estremità e assicurano che il DNA replichi in modo corretto e le estremità non diventino appiccicaticce.
Se si introducono delle sequenze telomeriche all'interno del cromosoma, nella regione in cui è stata inserita
la sequenza il DNA si rompe e il cromosoma viene spezzato in due. Quindi si è utilizzato il DNA telomerico
per rompere il cromosoma Y nelle sequenze alfoidi centromeriche e ottenere due cromosomi, ciascuno
formato da un braccio corto con 140 kb di DNA alfoide e un braccio lungo con 480 Kb di DNA alfoide.
Quest'ultimi hanno un numero ridotto di sequenze alfoidi ma continuano a segregare correttamente in
mitosi. Successivamente utilizzando quest'ultimi cromosomi si è cercato di effettuare una ricombinazione
omologa utilizzando dei plasmidi che contenevano brevi ripetizioni di DNA  satellite e delle sequenze
telomeriche per dividere ulteriormente la regione centromerica in maniera tale da aumentare la precisione
del taglio delle regioni di DNA alfoide centromerico e capire se anche in questo caso i cromosomi
continuavano a segregare correttamente. Infatti, si è visto che nelle generazioni successive, le sequenze
alfoidi anche in numero inferiori riuscivano a mantenere l'identità e quindi a segregare in maniera corretta e
a ricostituire le parti centromeriche, rese visibili da marcatori. Quindi dedussero che le sequenze alfoidi sono
importanti ma non fondamentali per la corretta segregazioni. S 
Quando si è visto che non c'era una sequenza con senso di DNA le ricerche si sono spostate ovviamente su
proteine o simili che assicurassero la funzionalità al centromero. E come spesso succede le informazioni più
importanti sono state fornite da organismi o individui che hanno delle mutazioni. Infatti, nel 1988 si vide che
in pazienti affetti da una malattia autoimmune definita “crest” possedevano nel loro siero una serie di
anticorpi anti-centromero, che non si riscontravano negli individui sani. Si è quindi, inseguito individuata la
prima proteina centromerica, CENP-A e successivamente tutte le altre proteine identificate finora (CENP-B,
CENP-C, CENP-G e CENP-H), che sono specifiche per il centromero. Tre di queste proteine hanno la
capacità di legarsi proprio al DNA centromerico e inoltre gli studi fatti hanno permesso di evidenziare in
ruolo principale della proteina CENP-A nell'assemblaggio di centromeri funzionalmente attivi e quindi
dell'identità centromerica. Iniziamo ora l'analisi dei centromeri dei maggiori organismi modello. Il
centromero Saccharomyces cerevisiae è stato il primo ad essere studiato ed è stato il primo ad essere
utilizzato per costruire cromosomi artificiali di lievito. Esso presenta centromeri puntiformi costituiti da una
sequenza conservata di 125 bp composta da tre elementi (CDEI, CDEII e CDEIII) in grado di organizzare le
proteine centromeriche in un cinetocore citologicamente però invisibile. CDEII è la regione centrale del
centromero chiamata anche core ed che è costituita da 78-86 bp, è ricca in AT (più del 90%) ed è 
fiancheggiata dalle sequenze conservate CDEI e CDEII. Quindi il DNA centromerico è contenuto in un
segmento di 220 bp protetto dal taglio delle nucleasi in cui si legano i microtubuli.  
Schizosaccaromyces pombe, invece,  che è poco più evoluto del precedente, ha un centromero di 40-100 kb
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Citogenetica molto più complesso e condivide molte caratteristiche con le regioni centromeriche eucariotiche. La
sequenza centrale del core è di circa 4-5 kb, costituita da DNA non ripetuto ma fiancheggiata da diverse
classi di grandi ripetizioni organizzate in orientamento invertito. Inoltre, l'assemblaggio completo
dell'eterocromatina viene mediato da RNAi (interfering), che richiede il complesso RNA-induced Initiation
Transcriptional Silencing (RITS) e una polimerasi Rdp1 (RNA-dipendente). L'RNAi sono normalmente
delle piccole sequenza di interfering RNA (siRNA) che possono interrompere il processo di traduzione
dell'mRNA o guidare la degradazione dell'mRNA. Quindi viene chiamato silenziamento post trascrizionale
del gene (PTGS, Post Transcriptional Gene Silencing) oppure inibire la trascrizione (TGS, Transcriptional
Gene Silencing). Negli ultimi anni, si è visto che nell'assemblaggio dell'eterocromatina mediato da RNAi, lo
siRNA favorisce  e mantiene il corretto posizionamento della cromatina nelle regioni pericentromeriche,
quindi fa sì che la regione centromerica dei due cromatidi rimanga assemblata insieme e si possano formare
bene i cinetocori e quindi l'assemblaggio delle fibre del fuso. Meccanismi simili sono stati descritti anche
per l'eterocromatina centromerica dei cromosomi umani, di topi e di cellule di pollo. In Drosophila, l'RNAi
direziona la formazione dell'eterocromatina centromerica, come in S. pompe, per questo su può dire che la
modificazioni della cromatina dirette dall'RNAi è un fenomeno comune negli eucarioti.  
Il DNA centromerico di Neurospora Crassa è lungo circa 400 Kb ed è costituito da lunghe ripetizioni, alcuni
simili a retrotrasposoni. In Caenorhabditis elegans, invece, assistiamo al fenomeno dei cromosomi
olocentrici, cioè in grado di assemblare il cinetocore lungo l'intera lunghezza quindi senza una sequenza
determinante specifica per il centromero. Arabidopsis thaliana presenta regioni centromeriche che variano in
lunghezza tra i 550 ed i 1260 Kb e contengono sequenze ripetute in tandem di circa 180 bp. Queste
ripetizioni, al contrario di quelle che si trovano nei mammiferi, sono trascritte e vengono processate
formando siRNA (small interfering) che  conferiscono a questa regione la funzionalità di centromero. In
Drosophila melanogaster, per definire la regione centromerica hanno usato lo stesso metodo utilizzato con il
cromosoma Y umano, e hanno ottenuto un minicromosoma definito Dp1187 lungo 1,3 Mb e derivato dal
cromosoma X. In centromero è costituito una parte centrale che contiene DNA satellite di 5 bp ed elementi
trasponibili, e fiancheggiato da altre sequenze ripetute. Mus musculus, invece, ha centromeri che sono
costituiti da sequenze di DNA ripetuto in tandem di 120 bp chiamato “satellite minor” il quale occupa circa
300 Kb in ogni cromosoma ad eccezione del cromosoma Y in cui è assente. Le ripetizioni di 120 bp
contengono una regione di 17 bp chiamata CENP-B box, presente anche nei primati, compreso l'uomo, e
importante per il legame con la proteina centromerica CENP-B. Infine, i Primati contengono nella regione
centromerica DNA alfoide chiamato anche  satellite ed è costituito da una sequenza di 171 bp ripetuta in
tandem circa 10.000 volte (molto grande) in tutti i centromeri dei primati incluso l’uomo, di queste 57 bp
altamente conservate e omologhe in tutte le coppie cromosomiche. La parte rimanente è molto variabile ed è
diversa nei vari cromosomi e quindi è utile per distinguerli. Il numero più basso di ripetizioni è presente nel
cromosoma Y umano (circa 200Kb). Il numero di ripetizioni non è importante per le funzioni del
centromero, infatti, il numero di sequenze che si ritrovano nelle regioni pericentromeriche possono essere
presenti in numero variabile e costituiscono quelle che vengono chiamate varianti morfologiche (di solito
cromosomi più grandi hanno più ripetizioni). La regione centromerica (array-schiena) è costituita da
monomeri di 171 bp, ai lati, invece, troviamo sia sequenze di DNA  satellite che sequenze ripetute in tandem
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Citogenetica di vario tipo, tra cui le sequenza SINE (shorts, corti inter-spersi elementi ripetuti) e LINE (longs, lunghi). A
parte quest'ultime sono presenti altre sequenze ripetute e altre sequenze satellite, per esempio, sul
cromosoma 9 umano nella regione pericentromerica esiste il satellite  (ripetizioni di 68 bp) e questa è una di
quelle regioni che sono morfologicamente variabili e la loro maggiore o minore estensione non ha effetti
fenotipici. 
 
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