Analisi della quantità di farmaco

Le caratteristiche principali di questo tipo di metodica sono le seguenti:
1. c'è un materiale adsorbente che quando passa la fase liquida aiuta la separazione
2. si basa su una separazione di tipo fisico
3. l'interazione tra la fase liquida e quella stazionaria è di tipo ionico, ci sono ioni in fase liquida legati alla fase stazionaria
4. c'è una separazione fatta sulla selezione delle dimensioni

Cromatografia a fase normale o inversa

La fase stazionaria è polare, mentre la mobile non è polare. Se la fase stazionaria è polare la userò per dosare o trattenere composti polari, all'inverso invece, se la fase stazionaria non è polare come ad esempio i polimeri di carbonio e la mobile è polare, tratterrò i composti non polari. In farmacologia, la maggior parte dei composti sono non polari, la maggior parte dei metodi cromatografici sono a fase inversa che utilizzano cioè i polimeri di carbonio come il sefadex.

HPLC (High Performance Liquid Chromatography)

È una macchina che dentro ha un contenitore con la fase mobile, rappresentata in genere da una soluzione di sali in solvente polare, che poi viene spinta da una pompa che presenta un iniettore, e a seconda del flusso avrò maggiore o minore velocità. Il campione finisce in una colonna contenente la fase stazionaria che nella maggior parte dei casi è rappresentato da un polimero di carbonio. All'uscita della colonna il campione passa attraverso un filtro e in un rivelatore, che legge la presenza del composto al suo interno. Se il composto è un cromoforo, si utilizza uno spettrometro di massa, la molecola viene spaccata e le frazioni sono rilevate in seguito alla collisione con gli ioni. Il rivelatore produce un segnale elettrico che viene registrato, il campione passa attraverso la fase stazionaria che lega tutti i componenti e a tempi diversi vengono registrati i diversi passaggi. 

Esistono due tipi di HPLC:
1. a eluizione isocratica, in cui la composizione della fase mobile è la stessa
2. a eluizione a gradiente, che ha delle pompe in grado di modificare la composizione della fase mobile nel tempo. Cambiando la concentrazione del metanolo, cambia la polarità e stacca le molecole dalla fase stazionaria in tempi diversi.
I rivelatori spettroscopici sono spettrofotometri che rivelano composti che assorbono in visibile ed UV e che portano alla lettura dell’assorbanza che è uguale al logaritmo della luce incidente (I0) fratto la luce trasmessa (I).
L'assorbanza da un indice della presenza o meno di un farmaco nel campione. Altri rivelatori poco usati sono quelli a fluorescenza, molto più usati invece, sono i rivelatori elettrochimici per composti che ossidano o si riducono e che possiedono un elettrodo in una cella dove passa il campione che viene ossidato o ridotto. Il rivelatore in spettrometria di massa è un apparecchio che sfrutta la collisione fra ioni ed è in grado di individuare il peso molecolare di un composto. È molto sensibile perché misura anche concentrazioni dell'ordine dei picogrammi. Con la cromatografia si eseguono analisi qualitative e quantitative, ci sono dei picchi che hanno ognuno il proprio tempo di ritenzione che è rappresentato dal tempo a cui la sostanza viene rilasciata dalla colonna. La linea di base deve essere la più piccola possibile, ma devo riuscire a capire quale è il composto che mi interessa. Per questo, prima di dosare il campione si esegue una curva standard dosando tre concentrazioni diverse come ad esempio 1, 0.5, 0.25 mg/ml. Prima viene fatta l'analisi qualitativa cioè studio a che tempo il mio composto viene fuori, poi dalla curva si ricavano le informazioni sulla concentrazione delle sostanze. La cromatografia produce dei picchi e l'integratore, integra l'area del picco e l'area del triangolo che è proporzionale a quella del campione. Vengono utilizzati quindi standard a tre concentrazioni diverse, che mi permetteranno di costruire un grafico con nell’asse delle ascisse (X) l'area, mentre nelle ordinate (Y) la concentrazione. L'analisi qualitativa ci darà il tempo di ritenzione, mentre l'analisi quantitativa ci darà quanto composto ho in un campione.

Cromatografia

1. Cromatografia in fase gassosa
2. Cromatografia in fase liquida (cromatografia piana su strato sottile o su carta, cromatografia su colonna).

Cromatografia in fase liquida su colonna (HPLC)

1. Cromatografia di adsorbimento
2. Cromatografia di ripartizione
3. Cromatografia di scambio ionico
4. Cromatografia di esclusione dimensionale
Nella cromatografia a fase normale la superficie della fase stazionaria è polare e diminuisce progressivamente, mentre la fase mobile è non polare. Nella cromatografia a fase inversa invece la superficie della fase stazionaria è non polare e aumenta progressivamente, mentre la fase mobile è polare.

Schema funzionale di HPLC

L'HPLC è costituito dalle seguenti parti:
1. Contenitore della fase mobile (l'eluizione può essere isocratica oppure a gradiente)
2. Pompa
3. Filtro
4. Iniettore
5. Colonna
6. Rivelatore collegato ad un Registratore o Calcolatore

Rivelatori

Le celle di rivelazione sono di 8 ul e possono essere:
1. Rivelatori spettroscopici ultravioletto (UV/visibile VIS), i quali misurano l'assorbanza dei composti che si ottiene dal logaritmo della luce incidente (I0) fratto la luce trasmessa (I).
Infrarosso vicino (NIR)     800-2500 nm
Visibile (VIS) 380-800 nm
Ultravioletto (UV) 210-380 nm
2. Rivelatori a fluorescenza, misurano l'emissione a lunghezza d'onda più elevata in seguito ad eccitazione di gruppi funzionali specifici quali gruppi funzionali aromatici, come ad esempio i benzeni.
3. Rivelatori elettrochimici che misurano il potenziale di ossido-riduzione del composto su di un elettrodo come entità di corrente prodotta.
4. Rivelatori in spettrofotometria di massa, i quali sfruttano la collisione fra ioni e sono in grado di individuare il peso molecolare di un composto. Sono molto sensibili, misurano concentrazioni dell'ordine dei picogrammi.