Valutazione del potenziale probiotico di ceppi di Lactobacillus isolati da Parmigiano-reggiano mediante screening sottrattivo

La popolazione lattica non starter (NSLAB) residente in alimenti fermentati è stata recentemente rivalutata come potenziale risorsa di ceppi probiotici. Nel presente lavoro, è stata analizzata l’attitudine probiotica di un set geneticamente de-replicato di 48 NSLAB (22 Lactobacillus rhamnosus, 18 Lactobacillus paracasei, 4 Lactobacillus casei, 2 Lactobacillus harbinensis e 2 Lactobacillus fermentum) isolati da differenti campioni di Parmigiano Reggiano stagionato. Proprietà tecnologiche (resistenza alle barriere biologiche), di sicurezza (antibiotico resistenza) e funzionali (adesività misurata come auto aggregazione, coaggregazione contro patogeni e idrofobicità) sono state valutate mediante uno screening in vitro sottrattivo. La maggior parte dei ceppi mostra resistenza a sali biliari, lisozima, succo gastrico sintetico e succo pancreatico, mentre nessun ceppo mostra resistenza a pH 2 dopo 6 ore di incubazione. In particolare 35% dei ceppi mostrano una sopravvivenza >40% a 1.5% (w/v) sali biliari coniugati (sodium cholate e sodium deoxycholate) ed una buona tolleranza a succhi gastrici e pancreatici. I tests di suscettibilità contro penicillina, ampicillina, cloramfenicolo, rifampicina, vancomicina, streptomicina e tetraciclina, mostrano che tutti i ceppi sono suscettibili agli antibiotici testati, con l’eccezione della vancomicina e della streptomicina. In particolare, il 77.6% dei ceppi mostra resistenza alla streptomicina, un aminoglicoside battericida che aumenta la mistranslation ribosomale, tuttavia gli stessi ceppi diventano sensibili quando valutati su mezzo contenente 0.5% di sali biliari. I dati suggeriscono che i sali coniugati dell’acido colico e deossicolico potrebbero agire impermeabilizzando la membrana e riducendo l’uptake intracellulare dell’antibiotico. Le proprietà cellulari di superficie, come l’idrofobicità, misurata mediante saggio BATH contro xilene, l’autoaggregazione, e la coaggregazione contro due patogeni alimentari, Escherichia coli e Salmonella enterica var. thyphimurium, sono indice non solo della capacità dei ceppi probiotici di colonizzare il GIT, ma anche di permanere in esso, inibendo la crescita dei patogeni per competizione. I risultati mostrano che: (i) 20 ceppi su 49 hanno una idrofobicità superiore al 50%; (ii) 9 ceppi (4 L. rhamnosus, 3 L. paracasei e 1 L. harbiniensis) mostrano valori molto significativi di autoaggregazione compresi fra il 51 e il 76%; (iii) la maggior parte dei ceppi mostra una ridotta coaggregazione con E. coli e ridottissima con S. thyphimurium. I ceppi con migliori proprietà autoaggreganti mostrano anche coaggregazione con E. coli, suggerendo che la due capacità sono correlate.
Infine per discriminare i lattobacilli inclusi nel presente studio sulla base di tutte le proprietà considerate, è stata effettuata un analisi delle componenti principali (PCA). I risultati hanno mostrato che 3 componenti riescono a spiegare il 53.2% della variabilità, con PC1 (25.2%) principalmente riconducibile alla suscettibilità agli antibiotici; PC2 (14.2%) prevalentemente spiegata dalla suscettibilità ai succhi gastrici e pancreatici; PC3 (13.6%) spiegata dalle proprietà di parete/membrana. Le proiezioni di PC1 verso PC2 e PC1 verso PC3 mostrano che i ceppi non sono raccolti in nuvole ben definite, a dimostrazione della grande variabilità del set di ceppi geneticamente non ridondanti. Tuttavia, nella prima proiezione possiamo evidenziare che i ceppi L. rhamnosus e 1 ceppo L. harbiniensis tendono a disporsi nel quadrante negativo per PC1 e negativo per PC2, indicando una buona performance per le proprietà di resistenza al GIT, mentre quelli L. paracasei nel quadrante positivo per il fattore 1, preferibilmente vicino al valore medio del fattore 2. La seconda proiezione evidenzia la stessa segregazione dei ceppi L. rhamnosus e L. paracasei in gruppi, con i ceppi L. rhamnosus e un ceppo L. harbiniensis con alti valori di auto aggregazione e idrofobicità.
In conclusione, il presente studio ha dimostrato che il Parmigiano Reggiano è un bacino di potenziali probiotici e ha proposto un pool di 3 ceppi (L. rhamnosus, L. harbiniensis e L. casei) con promettente attitudine probiotica per le prove in vivo.