Produzione di peptidi biologicamente attivi e loro interazione con nanosistemi

I peptidi bioattivi sono potenziali modulatori di processi regolatori dell'organismo grazie alla loro capacità di legarsi a recettori specifici coinvolti in diverse attività metaboliche quali la modulazione dei processi di assorbimento a livello intestinale, la regolazione della pressione arteriosa, la modulazione della risposta immunitaria, effetti antimicrobici, effetti antitrombotici, ed effetti oppioido-simili. È possibile ottenere per idrolisi peptidi contenenti serina fosforilata (CPP), mantenendo contemporaneamente la loro capacità di legare il calcio. Questo aspetto è particolarmente interessante in quanto numerosi studi hanno dimostrato la maggiore efficacia dei fosfopeptidi derivati dalla β-caseina nel modulare l'assorbimento di minerali in generale e del Ca²⁺ in particolare. Numerosi autori hanno anche dimostrato il ruolo di questi peptidi come modulatori di alcune funzioni metaboliche. Altri studi hanno dimostrato l'attività come stimolatori dell'assorbimento di minerali, e del calcio in particolare, da parte dei fosfopeptidi caseinici sia in vitro sia in vivo. Complessivamente tutti questi studi suggeriscono la necessità di avere prodotti arricchiti di CPP in maniera consistente oppure con CPP a più alta bioattività. Il problema principale dell'inserimento dei fosfopeptidi nella dieta con prodotti alimentari riguarda una somministrazione quantitativamente troppo elevata per esplicare in modo funzionale e positivo questa loro attività biologica. Si è notato che alla concentrazione specifica bassa relativa ai CPP ottenuti (un'alta percentuale rimaneva libera in soluzione) risulterebbe una dose minima efficace troppo elevata in termini quantitativi per avere effetti positivi. Nel corso di questo progetto di tesi sperimentale si è voluto studiare proprio quest'aspetto relativo ai CPP e alla loro concentrazione specifica indagandone un possibile aumento con lo studio di un modello di sistema in cui l'interazione di nanoparticelle idrofobiche di polistirene con i CPP ottenuti dalle caseine del latte potesse portare sempre ad un legame del calcio da parte del sistema costruito e, contemporaneamente, ad un aumento della loro concentrazione specifica in soluzione. La materia di partenza è stata del caseinato di sodio commerciale di latte bovino. L'ottenimento d'idrolizzati da caseina è avvenuto con l'utilizzo di un ultrafiltratore a membrana (a ricircolo semi-continuo) seguendo idrolisi controllate per tempo e temperatura (prima ad intervalli regolari di 10 minuti per un totale di 90 minuti e successivamente in continuo per 90 minuti a 55°C con l'ausilio di un bagnetto termostatato) ed utilizzando enzimi quali tripsina, e proteasi quali Europa 2 e Amano N per la digestione enzimatica delle caseine. Gli idrolizzati ottenuti sono stati liofilizzati. Successivamente l'isolamento di fosfopeptidi è stato ottenuto mediante precipitazione con nitrato di bario seguendo un protocollo standard, con una resa complessiva media pari a circa il 10%. Per l'allontanamento dalla soluzione degli ioni bario, citotossici per le cellule intestinali, si è proceduto mediante RP-HPLC con una colonna di tipo semi-preparativa C- 18. La caratterizzazione è stata condotta con una cromatografia a fase inversa RP-HPLC - confrontando i fosfopeptidi ottenuti con gli idrolizzati ottenuti dopo ultrafiltrazione - e mediante SDS-PAGE. Sono state quindi effettuate in primo luogo delle prove in doppio di adsorbimento di idrolizzati tal quali e di fosfopeptidi a concentrazione crescente (da 0.1 fino a 2.5 mg/mL), su quantità fisse di nanoparticelle di polistirene, misurando la quantità di materiale non legato. Si è quindi provveduto ad indagare la tipologia di fosfopeptidi legati presenti (30% sul totale) mediante RP-HPLC, confrontando i tracciati ottenuti dopo isolamento e prima di effettuare le prove di adsorbimento. La caratterizzazione ha purtroppo evidenziato tracciati quasi del tutto simili tra di loro. L'assenza di specificità nel legame suggerisce quindi la necessità di riprogettare il sistema di legame fosfopeptidi-nanoparticelle di polistirene utilizzando altri tipi di legame e non quello solamente idrofobico studiato durante questo progetto sperimentale. I risultati ottenuti in questo lavoro hanno tuttavia permesso di dimostrare quanto sperimentalmente ci sia da indagare sul ruolo che queste nanostrutture idrofobiche possano ricoprire come modulatori di processi di assorbimento di minerali.