Proteina P2 da Haemophilus influenzae - Sintesi, caratterizzazione strutturale e attività biologica dei loop superficiali

La membrana esterna dei batteri Gram-negativi contiene diverse proteine denominate Outer Membrane Protein (OMPs), tra queste le porine sono le più abbondanti e svolgono un ruolo fondamentale nell’interazione del batterio con la cellula ospite.
La proteina di membrana più abbondante dell’Haemophilus influenzae non typeable (NTHI) è la proteina P2. Il modello tridimensionale presenta la struttura b tipica delle porine. In questo lavoro di tesi, è stata analizzata l’attività di tutti i loop superficiali con particolare interesse per i loop L5 (Lys206-Gly219), L6 (Ser239-Lys253) e L7 (Thr280-Lys287) che, come si evince dal modello tridimensionale, sembrano non avere alcuna funzione strutturale, ma come dimostrato sperimentalmente, sono in grado di attivare, come l’intera proteina, le vie di trasduzione del segnale ed in particolare la cascata delle chinasi Raf/MEK1/MEK2/MAPK.
Per determinare l’importanza strutturale e funzionale di ciascun residuo del loop L7, che tra i tre peptidi è quello più attivo, sono stati sintetizzati peptidi in cui si è variata la lunghezza e la sequenza amminoacidica.
E’ stato quindi esaminato il ruolo di questi peptidi sintetizzati nell’induzione del fattore di necrosi tumorale (TNF-a) e nell’espressione della citochina IL-6, mediate dalle MAP chinasi p38 e JNK, essendo queste le citochine proinfiammatorie più studiate perché causa di molti dei sintomi e dei segni che accompagnano l’infiammazione. Al fine di stabilire i residui chiave contenuti nel segmento peptidico, che va dal residuo amminoacidico 280 al residuo 287 della porina P2, sono stati sintetizzati una serie di peptidi in cui di volta in volta ciascun residuo è stato sostituito con un alanina per determinare l’abilità dei peptidi mutati ad indurre l’attivazione della trasduzione del segnale e il rilascio di TNF-a e IL-6.
I dati dell’attività biologica insieme ai risultati suldicroismo circolare ed ai dati della dinamica molecolare, hanno mostrato che 6 su 8 residui amminoacidici del loop L7 contribuiscono significativamente all’ attività totale.
Impiegando simulazioni di dinamica molecolare è stato dimostrato che modifiche di L7, che portano all’incremento della rigidità del loop e ad una tendenza maggiore a formare strutture elicoidali, riducono l’attività del peptide in esame.
Questo lavoro di tesi ha portato ad una maggiore conoscenza a livello molecolare della porina P2 ed ha fornito importanti informazioni sul meccanismo d’attivazione della trasduzione del segnale che porta alla produzione dei fattori dell’infiammazione TNF-a e IL-6. I risultati ottenuti indicano chiaramente che tutti i residui analizzati sono coinvolti nell’attivazione della via MAPK e nella produzione di TNF-a ed IL-6 e potrebbero essere utilizzati per la progettazione di nuovi peptidi o peptidomimetici che presentino maggiore attività o risultino utili per lo sviluppo di nuove terapie.