Proteina P2 da Haemophilus influenzae - Sintesi, caratterizzazione strutturale e attività biologica dei loop superficiali

     SOMMARIO  II 
 
        I dati dell’attività biologica insieme ai risultati suldicroismo circolare ed ai 
dati della dinamica molecolare, hanno mostrato che 6 su 8 residui 
amminoacidici del loop L7 contribuiscono significativamente all’ attività totale. 
Impiegando simulazioni di dinamica molecolare è stato dimostrato che 
modifiche di L7, che portano all’incremento della rigidità del loop e ad una 
tendenza maggiore a formare strutture elicoidali, riducono l’attività del peptide 
in esame. 
Questo lavoro di tesi ha portato ad una maggiore conoscenza a livello 
molecolare della porina P2 ed ha fornito importanti informazioni sul 
meccanismo d’attivazione della trasduzione del segnale che porta alla 
produzione dei fattori dell’infiammazione TNF-a e IL-6. I risultati ottenuti 
indicano chiaramente che tutti i residui analizzati sono coinvolti nell’attivazione 
della via MAPK e nella produzione di TNF-a ed IL-6 e potrebbero essere 
utilizzati per la progettazione di nuovi peptidi o peptidomimetici che presentino 
maggiore attività o risultino utili per lo sviluppo di nuove terapie. 
 
 
Capitolo 1 
Introduzione 
 
1.1 LA PARETE CELLULARE DEI BATTERI GRAM-NEGATIVI  
  
La parete cellulare dei batteri Gram-negativi è una struttura 
pluristratificata piuttosto complessa (Fig. 1). Essa è costituita da: uno strato 
rigido e sottile (2-3mm) di peptidoglicani che conferisce la forma alla cellula 
batterica e ne impedisce la lisi osmotica; uno spazio periplasmatico ricco di 
proteine1; una membrana esterna. 
 
Fig. 1:  Struttura della parete cellulare dei batteri Gram-negativi  
 
La membrana esterna è costituita da un doppio strato fosfolipidico 
(bilayer) contenente: lipidi, lipopolisaccaridi (LPS),  porine e lipoproteine.  La 
funzione più importante della membrana esterna dei batteri Gram-negativi è 
quella di costituire un filtro molecolare che permetta la diffusione soltanto di 
piccole molecole idrofiliche  (ioni, metaboliti); impedendo la penetrazione nella 
cellula di sostanze tossiche come lisozima e antibiotici idrofobici (attinomicina, 
benzilpenicillina, vancomicina, etc.).  
                                               
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 Enzimi idrolitici, che degradano grosse molecole per favorire il loro trasporto attraverso la membrana citoplasmatica, 
ed enzimi detossificanti, in grado di inattivare alcuni farmaci antibatterici. 
     Capitolo 1: Introduzione  2 
Essendo la membrana esterna la struttura più superficiale della cellula 
batterica, essa è strettamente coinvolta nell’interazione batterio patogeno-ospite 
ed i suoi costituenti svolgono un ruolo critico nella patogenesi dell’infezione 
batterica. 
 Le lipoproteine ancorano la membrana esterna al peptidoglicano 
sottostante, che è una massa spongiforme costituita da un polimero con legami 
crociati. Il polimero è formato da catene poli-aminoglucosidiche incrociate con 
catene polipeptidiche (Fig.2).  
 
                      
 Fig. 2:  Struttura del peptidoglicano 
 
 Le unità di base del peptidoglicano vengono costruite all’interno del 
citosol e  mano a mano che vengono assemblate in strutture più complesse, esse 
vengono estruse fuori dal citoplasma. Le fasi finali dell’assemblamento 
     Capitolo 1: Introduzione  3 
avvengono al di fuori della membrana citoplasmatica. Il peptidoglicano 
costituisce un target farmacologico molto importante, perché la maggior parte 
degli enzimi coinvolti nella costruzione della parete cellulare non trova il 
corrispettivo con enzimi delle cellule dei mammiferi, per questo motivo essi 
sono il bersaglio di potenti antibatterici senza alcuna tossicità per l’ospite. 
 Il lipopolisaccaride (LPS), che è il responsabile della tossicità 
dell’involucro esterno dei batteri gram-negativi, è costituito da tre regioni ben 
distinte: una porzione lipidica inserita nel foglietto esterno della membrana, una 
porzione centrale oligosaccaridica e una porzione polisaccaridica, legate tra loro 
covalentemente (Fig.3). 
 
             
 Fig. 3:  Struttura del lipopolisaccaride 
 
La porzione lipidica, detta lipide A, è costituita da un dimero di 
glucosammina (b-1,6–D–glucosammina) fosforilata, al quale sono legate catene 
di acidi grassi saturi il cui scheletro raggiunge una lunghezza di 12-16 atomi di 
carbonio. Il lipide A è il solo responsabile dell’attività endotossica associata 
all’LPS ed è direttamente coinvolto nella genesi della sintomatologia di molte 
malattie infettive, rendendosi, in particolare, responsabile dell’attività pirogena 
dell’LPS (1-10).  
     Capitolo 1: Introduzione  4 
 La porzione centrale, detta porzione comune o core, è una corta catena di 
zuccheri, caratterizzata dalla presenza costante di due zuccheri peculiari, l’acido 
chetodeossioctonoico o KDO e un eptoso, rappresentato in genere da L–glicero–
D–mannoeptoso. 
 La porzione polisaccaridica, detta antigene somatico o antigene O, è 
costituita da unità tri, tetra o penta–saccaridiche ripetute da 20 a 50 volte, le 
quali formano una catena idrofilica che si estende al di sopra della membrana 
esterna. L’antigene O, dotato di spiccate proprietà antigeniche, differisce da una 
specie batterica all’altra nel tipo e nella sequenza degli zuccheri che lo 
costituiscono.  
Il lipopolisaccaride induce la produzione di citochine, come il TNF-a, e di 
interleuchine, come IL-1, IL-6 e IL-8, e inoltre l’attivazione del complemento 
attraverso la via alternativa (1-5, 10). 
Le proteine costituiscono circa la metà della massa della membrana esterna 
dei batteri Gram-negativi e sono localizzate sia sulla superficie che all’intero 
della membrana, svolgendo molteplici funzioni. 
Alcune delle proteine più importanti della membrana esterna dei batteri 
Gram-negativi sono:  
 Le adesine che consentono al batterio di aderire intimamente alla 
superficie della cellula ospite per colonizzarla; 
 Le invasine che consentono al batterio di invadere la cellula ospite;  
 Le proteine che svolgono ruoli strutturali (OmpA), poiché la loro 
assenza determina fragilità;  
 Le porine, che formano attraverso la membrana dei canali per la 
diffusione passiva di piccole molecole idrofiliche, come glucosio, 
amminoacidi e ioni. 
 
 
 
 
 
 
     Capitolo 1: Introduzione  5 
 
1.2   LE PORINE 
Le porine rappresentano più del 50% delle proteine totali della membrana 
esterna dei batteri Gram-negativi. Sono così chiamate poiché, associate in 
trimeri, formano nella membrana esterna dei pori attraverso i quali si ha la 
diffusione di alcune sostanze come metaboliti e ioni. Esse rappresentano un 
filtro alla penetrazione delle molecole all’interno della cellula. Consentono il 
passaggio di molecole con peso molecolare fino a circa 1400 Dalton. Ceppi 
mutanti difettivi nelle porine crescono più lentamente rispetto ai ceppi normali 
in conseguenza della ridotta penetrazione di nutrienti quali amminoacidi, 
zuccheri, etc. 
 Le porine si dividono in specifiche e non specifiche. Le porine non 
specifiche formano dei canali idrofili che consentono la diffusione passiva di 
piccoli metaboliti. Queste, pur non essendo specifiche per alcuna molecola, 
possono essere selettive nei confronti di cationi o anioni. Le porine specifiche, 
invece, contengono siti di legame selettivi per alcuni substrati di cui consentono 
una più rapida ed efficiente diffusione. Molte tra queste sono inducibili e le 
quantità prodotte dipendono dalle condizioni di crescita.  
 
   
1.2.1 Struttura delle porine 
Importanti progressi nello studio delle porine si sono avuti in seguito alla 
risoluzione delle strutture cristallografiche di alcune proteine appartenenti a 
questa classe (11-16). L’analisi cristallografica ha rilevato che tutte le porine, 
nonostante la loro struttura primaria vari in modo sorprendente, (le porine dei 
batteri Gram-negativi hanno massimo il 30% d’identità di sequenza) presentano 
dei motivi strutturali comuni. Le porine esistono come omotrimeri in cui le tre 
subunità sono intimamente associate. Ciascuna subunità contiene 250-450 
residui amminoacidici e forma, quasi interamente, una struttura b-antiparallela. 
Ogni monomero è costituito da 16 filamenti b-anfipatici nelle porine 
aspecifiche e 18 in quelle specifiche ed ogni filamento b-anfipatico è costituito 
da 7-14 residui amminoacidici. Dal lato del periplasma i filamenti b sono 
     Capitolo 1: Introduzione  6 
connessi da 8 loop (L1-L8) di lunghezza variabile nelle porine aspecifiche e 9 
nelle specifiche mentre dal lato del citoplasma i filamenti b sono collegati da 7 
brevi turn (T1-T7) nelle porine aspecifiche e da 8 nelle specifiche.  La struttura 
b attraversa per intero la membrana e la sua sezione trasversale mostra, come 
indicato in Fig. 4, che uno dei loop (L3) è ripiegato all’interno del poro 
restringendo il canale e determinandone le dimensioni e di conseguenza la 
selettività  molecolare (17). 
               
     Capitolo 1: Introduzione  7 
Fig. 4: Struttura del monomero della porina Phoe di Escherichia coli: A) Proiezione sul piano 
orizzontale del  b-barrel; B) Sezione trasversale. I b-strand sono indicati in azzurro, i loop e i 
turn in verde, e l’elica in rosso. 
 
Le dimensioni del canale e la natura dei residui amminoacidici localizzati 
al suo interno determinano le proprietà fisiologiche e di conduttività del poro. Il 
campo elettrostatico interno al canale fornisce le proprietà di filtro per gli ioni e 
può contribuire al fenomeno di chiusura del poro voltaggio dipendente. 
Una serie di lavori sperimentali in cui i vari loop sono stati accorciati 
singolarmente oppure simultaneamente hanno dimostrato che essi non svolgono 
alcun ruolo strutturale, in altre parole non sono in grado di determinare la 
topologia della catena polipeptidica all’interno della membrana, come avviene 
per le proteine di membrana citoplasmatiche in cui, questa, è fortemente 
influenzata dalla distribuzione di carica delle regioni extramembrana. In 
particolare, è stato dimostrato che una porina privata di tutti i loop 
extramembrana conserva ancora la potenzialità di generare una struttura simile a 
quella della proteina nativa. Questi risultati escludono ogni possibilità che 
qualche informazione topologica sia contenuta nei loop. 
L’analisi delle strutture cristallografiche delle porine evidenzia che la 
maggior parte dei residui aromatici (Phe, Tyr, Trp) punta verso l’esterno della 
struttura b ed interagisce strettamente con i fosfolipidi di membrana (18), 
probabilmente per ancorare la proteina alla membrana. 
Le porine oligomerizzano dando luogo a trimeri (Fig. 5), tuttavia la 
funzione dell’oligomerizzazione non è ben nota.