Clonaggio del cDNA per il fattore di differenziamento eritrocitario EDRF e studio della sua espressione nell’uomo

I prioni rappresentano una classe di agenti infettivi distinta da virus, batteri funghi ed altri patogeni noti. Sono ritenuti i principali agenti eziologici delle Encefalopatie spongiformi trasmissibili o TSE, un gruppo di neuropatologie degenerative che colpiscono sia l’uomo, sia gli animali. I prioni rappresentano degli agenti patogeni di natura proteica in grado di veicolare e generare malattia senza il coinvolgimento degli acidi nucleici.
Le malattie prioniche sono patologie degenerative del SNC e colpiscono sia l’uomo, sia gli animali; esse presentano tratti istopatologici distintivi che comprendono la denerazione spongiforme, la gliosi astrocitica, la presenza di placche amiloidi e la mancanza di risposta infiammatoria.
Le malattie zooprioniche più conosciute sono la BSE e la scrapie (negli ovini e nei caprini), mentre nell’uomo la patologia di maggiore interesse è la nvCJD.
A fronte di un quadro istopatologico ben definito delle TSE, rimangono ancora sconosciuti i meccanismi molecolari attraverso i quali le particelle prioniche conducono alla neurodegenerazione. Inoltre la mancanza di risposta infiammatoria testimonia la capacità dei prioni di eludere i meccanismi di controllo del Sistema Immunitario. Tale condizione fa sì che alla comparsa dei sintomi il danno tissutale abbia già raggiunto uno stadio avanzato. In questo senso risulta fondamentale la messa a punto di test diagnostici in grado di identificare precocemente i portatori delle TSE.
A tale proposito è stata messa in evidenza l’importanza di un fattore di differenziamento eritrocitario, denominato EDRF, quale marker periferico delle TSE poichè l’espressione di tale fattore viene considerevolmente ridotta in topi infettati con la scrapie, in bovini affetti da BSE ed ovini affetti da scrapie L’EDRF rappresenta quindi la prima dimostrazione di un effetto TSE indotto in tessuti che non fanno parte del SNC.
L’EDRF svolge inoltre un ruolo fondamentale nel processo di biosintesi dell’emoglobina tetramerica, mantenendo in soluzione le molecole di α-globina libera e per tale ragione è stato altresì denominato AHSP (α-hemoglobin stabilizing protein). Invece non è a tutt’oggi noto quali siano i processi che si verificano nell’ambito della malattia prionica che vedono la partecipazione dell’EDRF.
Lo scopo del presente lavoro di ricerca è stato la valutazione, prendendo in esame un campione di individui estratto da una popolazione umana “normale”, dei livelli di espressione del fattore di differenziamento eritrocitario EDRF Tale studio risulta fondamentale per una successiva valutazione di eventuali modificazioni dell’entità della sua espressione in particolari condizioni patologiche.
Le analisi sperimentali sono state condotte a partire dall’estrazione dell’RNA totale da sangue periferico relativo agli individui presi in esame; successivamente l’RNA è stato assoggettato a migrazione elettroforetica su gel di agarosio in condizioni denaturanti e successivamente trasferito, attraverso la metodica del Northern Blot, su membrana di nylon. I filtri così ottenuti sono stati quindi sottoposti ad ibridazione con una sonda marcata radioattivamente e specifica per il messaggero dell’EDRF umano. Dopo aver sottoposto i suddetti filtri ad autoradiografia su lastra, si è proceduto alla determinazione quantitativa del messaggero mediante un’analisi densitometrica della banda presente su ciascun campione e relativa al trascritto per l’EDRF. I dati ottenuti sono stati quindi elaborati con metodi statistici.
Per realizzare la sonda impiegata negli esperimenti di ibridazione si è partiti dall’RNA totale estratto da sangue intero umano e si è proceduto alla sua retrotrascrizione. Il prodotto ottenuto è stato dunque amplificato mediante PCR in maniera tale da ottenere un frammento da 453 bp contenente l’intera porzione codificante e una parte delle regioni 3’ e 5’UTR, relative al messaggero per il gene in questione.
Tale frammento è stato inoltre clonato in pGEM®-T Easyal fine di ottenere un vettore ricombinante impiegato per la successiva trasformazione di cellule competenti JM109 di E. coli. Una volta cresciute le colonie ed effettuato lo screening dei cloni ricombinanti, da questi è stato estratto il DNA plasmidico. Quest’ultimo è stato quindi sottoposto ad amplificazione mediante PCR, digestione enzimatica ed analisi della sequenza nucleotidica, prove che hanno confermato l’identità del frammento clonato, rendendo pertanto possibile il suo impiego per gli esperimenti di ibridazione.