Clonaggio del cDNA per il fattore di differenziamento eritrocitario EDRF e studio della sua espressione nell’uomo

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Di fatto attraverso trattamenti chimici, fisici ed enzimatici effettuati su estratti di 
tessuto cerebrale ovino scrapie-infetto, è stata condotta un’indagine accurata sulla 
natura biochimica dell’agente prionico, presunta causa dei focolai di scrapie. Tale 
analisi ha rivelato che il prione viene inattivato, perdendo la sua capacità infettiva, se 
sottoposto a digestione con tripsina (100 µg/ml) o con proteinasi K (100 µg/ml); lo 
stesso risultato si ottiene dopo trattamento con:  
- DEPC (10-20 mM), 
- fenolo (in condizioni di saturazione), 
- urea (3-8 M), 
- GTC (1 M), 
- SDS (1-10%). 
Al contrario l’agente prionico mostra spiccata resistenza alla digestione con 
ribonucleasi (0,1-100 µg/ml) e deossiribonucleasi (100 µg/ml); inoltre mantiene la 
sua stabilità se sottoposto a: 
- irraggiamento UV a 254 nm, 
- idrolisi catalizzata da Zn²
+
 (2 mM), 
- fotoreazione con psoralene, 
- trattamento con idrossilammina (0,1-0,5 mM), 
- riscaldamento a 90°C per 30 minuti. 
L’effettiva ritenzione della capacità del prione di generare la malattia per via 
iatrogena in animali sani è stata poi saggiata mediante inoculo sperimentale in sede 
intracerebroventricolare (anche per os seppur con minor efficienza di trasmissione) 
degli estratti sottoposti ai diversi trattamenti. Si è concluso che procedure 
normalmente impiegate per la denaturazione proteica sono in grado di inattivare 
anche la particella prionica, la quale invece resiste ai normali trattamenti messi in 
 3
atto per degradare gli acidi nucleici (1). Questo ha permesso innanzi tutto di 
escludere la natura virus-simile del prione scatenante la scrapie e 
contemporaneamente di postulare il mancato coinvolgimento (almeno diretto) degli 
acidi nucleici nel processo infettivo che invece risulta veicolato da una particella di 
natura proteica: il prione (3). 
In questo senso S. B. Prusiner, ha dato l’incipit al concetto di “ipotesi prionica” 
secondo la quale una serie di disordini a carico del SNC di animali e più raramente 
dell’uomo vede come causa scatenante l’intervento di “una particella proteica e 
nient’altro”. 
Una parte del mondo scientifico è ancora in difficoltà nei confronti di una scoperta 
così recente che sembra scuotere i dogmi della biologia. Tutti gli agenti infettivi di 
fatto includono nella loro struttura, per quanto semplificata essa sia, un quantitativo 
minimo di materiale genetico (DNA o RNA), in cui risiede il “progetto” 
dell’organismo stesso; questo gli conferisce la capacità di replicarsi una volta 
all’interno dell’ospite e di generare la patologia. Nel caso dei prioni sono le particelle 
proteiche stesse, prive di materiale genetico, ad essere in grado di autoreplicarsi e di 
determinare l’insorgenza delle TSE. 
 
1.1.2 Il prione: una proteina, due isoforme 
Prusiner oltre a proporre la particella prionica come un rivoluzionario agente 
infettivo, ha il merito di averne effettuato una prima caratterizzazione strutturale; 
esperimenti di gel filtrazione, centrifugazione in gradiente di saccarosio e 
elettroforesi su gel hanno rivelato che la sua massa molecolare era di poco inferiore 
ai 50.000 daltons (1, 3); ulteriori studi condotti sulla scrapie hanno permesso di 
 4
individuare nei tessuti infetti la presenza di tale componente proteica (4), a cui è poi 
stato attribuito il termine di PrP. 
Nel 1984 è stata identificata una corta sequenza di 15 aminoacidi ad una estremità 
della PrP e ciò ha permesso la realizzazione di sonde molecolari utilizzate per la 
localizzazione cromosomica del gene codificante tale proteina. Nell’uomo il gene per 
la PrP
 
prende il nome di PRNP ed è localizzato nel braccio corto del cromosoma 20, 
mentre nel topo tale gene è noto come Prn-p e si localizza nel cromosoma 2 (5). La 
scoperta interessante consiste nell’osservare che l’espressione della particella PrP
 
in 
varie specie di mammiferi, tra cui l’uomo e il topo, non è associata a patogenesi; 
questa evidenza sperimentale ha determinato la formulazione dell’ipotesi secondo la 
quale la proteina PrP può presentarsi sotto due isoforme, una fisiologicamente 
innocua definita PrP
c 
(c = cellular) o PrP
sens
 (proteasi-sensibile) ed una patologica 
denominata PrP
Sc 
(Sc = scrapie) o PrP
res
 (proteasi-resistente) (6). 
 
1.1.3 Caratteristiche strutturali e funzionali di un prione 
In campioni di tessuto nervoso di criceti appartenenti alla linea SHa (Syrian 
hamster), infettati per via sperimentale mediante inoculo di estratti tissutali di 
animali affetti da scrapie, la particella prionica PrP si presenta come una 
glicoproteina di 254 aminoacidi associata a 2 residui glucidici; ha una massa  
molecolare compresa tra 33.000 e 35.000 daltons e risulta esposta sul lato 
extracellulare della membrana plasmatica mediante un saldo ancoraggio con il 
glicosil-fosfatidilinositolo (GPI), componente caratteristico delle membrane 
plasmatiche eucariotiche (7). Una parte della PrP subisce processamento post-
traduzionale alle estremità COOH- e NH
2
-terminale, originando le due isoforme 
 5
prioniche entrambe costituite da 209 residui aminoacidici, quella fisiologica (PrP
c
) 
che rimane esposta sulla superficie membranaria mediante l’ancoraggio con il GPI e 
quella patologica (PrP
Sc
) contenuta in vescicole nella frazione citoplasmatica (6). 
Sottoponendo i sopra citati estratti a digestione enzimatica con proteinasi K per 30 
minuti a 37°C, si evidenzia l’idrolisi completa della particella PrP
c
 e dei primi 67 
aminoacidi della proteina PrP
Sc
; di questa componente rimane quindi solo un 
polipeptide composto da 142 aminoacidi, del peso molecolare stimato tra 27.000 e 
30.000. Il polipeptide in questione rappresenta il core proteasi-resistente della 
particella PrP
Sc
 rilasciato a seguito del taglio proteolitico all’estremità COOH-
terminale, e per le sue dimensioni prende il nome di PrP 27-30 (Figura 1) (8). 
 
Figura 1. Processamento della particella PrP 
 
Successivamente all’individuazione della particella PrP 27-30 sono stati realizzati 
anticorpi in grado rilevare la presenza del residuo proteico da 142 aminoacidi 
all’interno di tessuti cerebrali umani e animali affetti da patologie prioniche. In 
questo senso le analisi condotte hanno dimostrato che il frammento PrP 27-30 
PrP 27-30 
PrP
Sc
 
PrP
c
 
PrP 
  CHO       CHO         GPI 
 SS 
 
        254 aminoacidi
       209 aminoacidi
       209 aminoacidi
      142 aminoacidi
 6
(digestione enzimatica postuma) è presente in tutti gli estratti cerebro-tissutali TSE-
infetti, mentre risulta non essere coinvolto in altri disordini neurodegenerativi come 
il morbo di Alzheimer, il morbo di Parkinson’s e la sclerosi laterale amiotrofica (9). 
A seguito di tale acquisizione si è attribuita notevole importanza all’isoforma 
proteica PrP
Sc
 (da cui si origina per proteolisi la PrP 27-30), come proteina specifica 
delle malattie prioniche essendo coinvolta nei processi di patogenesi e trasmissione 
delle TSE. 
Le particelle PrP
c
 e PrP
Sc 
rappresentano isomeri conformazionali (conformeri) di una 
singola sequenza proteica; per quanto concerne la loro struttura secondaria, esse 
differiscono sensibilmente pur conservando la medesima sequenza aminoacidica 
(struttura primaria). Analisi di spettroscopia FTIR (Fourier Transform Infra-Red) e 
dicroismo circolare (CD) hanno rivelato che la proteina PrP
c 
si presenta con un 
elevato contenuto in α-eliche (42%) e risulta quasi scevra da foglietti β (3%), mentre 
i dati relativi alla componente PrP
Sc
 indicano abbondanza di foglietti β (43%) e 
ridotta presenza di α-eliche (30%). Una netta prevalenza di foglietti β (54%) rispetto 
alle α-eliche(21%) si riscontra inoltre nella componente proteolitica PrP 27-30 e ciò 
rappresenta un’ulteriore prova sperimentale che il suddetto frammento rappresenta 
un residuo della particella infettiva PrP
Sc
 (10). 
Al fine di determinare la struttura terziaria delle particelle prioniche PrP
c
 e PrP
Sc
, 
sono state effettuate analisi di spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR), 
in considerazione delle difficoltà incontrate nell’ottenimento di cristalli di tali 
proteine che potessero essere analizzati con la metodica della cristallografia a raggi 
X. Per ciò che riguarda l’isoforma fisiologica si è andati ad indagare la struttura di 
proteine ricombinanti (SHaPrP e MoPrP) e questo ha permesso di rilevare la 
presenza di 3 porzioni ad α-elica, HA (H = helix) compresa tra i residui aminoacidici 
 7
144 e 157, HB ( residui 172-193) e HC (residui 200-227). Si è inoltre riscontrata la 
presenza dei due foglietti β S1 (S = sheet) nel tratto aminoacidico 129-134 e S2 
(residui 159-165) (11). Il modello 3D proposto per la particella patogena PrP
Sc 
scaturisce dall’analisi strutturale effettuata sia sulla proteina stessa, che sul 
frammento PrP 27-30 e rivela la presenza di 4 foglietti β riuniti in 2 porzioni, S1 
(residui 108-113 e 116-122) e S2 (residui 128-135 e 138-144). Accanto alle 
conformazioni β si ritrovano 2 α-eliche definite H3 (residui 178-191) e H4 tra i 
residui 202 e 218 (Figura 2) (12). 
 
 
Figura 2. Struttura 3D delle proteine prioniche: a) isoforma fisiologica PrP
c
 e b) 
isoforma patologica PrP
Sc
 
 
 8
Partendo dai risultati sopra ottenuti è sempre più accreditata l’ipotesi secondo la 
quale alla base dell’insorgenza delle patologie prioniche, in tessuti originariamente 
sani, vi sia la conversione intracellulare di PrP
c
 in PrP
Sc
. Tale meccanismo è 
caratterizzato da un refolding delle α-eliche (tra i residui aminoacidici 90 e 140) della 
particella PrP
c
 che riarrangiandosi nello spazio originano dei foglietti β, generando 
così la proteina infettiva PrP
Sc 
che si accumula a livello citoplasmatico (12). Le 
modalità con cui si svolge questo processo non sono ancora note, ma studi condotti 
in questo senso inducono a pensare che il passaggio dall’isoforma fisiologica a quella 
patologica sia mediato da un agente di natura polipeptidica definito “proteina X” 
(13). Nelle diverse teorie proposte per spiegare tale meccanismo di conversione, la 
proteina X appare come un fattore in grado di legarsi ad un sito specifico della 
particella PrP
c 
(alla sua estremità C-terminale), determinando la formazione del 
complesso PrP-proteina X; questo a sua volta interagisce con una particella PrP
Sc
 già 
presente, generando così l’intermedio trimerico PrP*, costituito dall’aggregazione di 
3 componenti: PrP
c
, proteina X e PrP
Sc
. Solo successivamente si ha la formazione di 
una nuova molecola PrP
Sc
, con il conseguente rilascio della proteina X che, secondo 
tale modello, viene descritta come uno chaperon molecolare in grado di diminuire la 
barriera cinetica tra i 2 isomeri conformazionali, grazie alla sua attività catalitica 
(Figura 3) (14).