Il test di reversione in Salmonella Typhimurium - Test di Ames

Il test di reversione con Salmonella typhimurium è stato proposto per la prima volta nel 1966 da N- Ames e dimostra che una serie di mutanti per l'amminoacido istidina sono in grado di subire reversione a seguito del trattamento con diverse classi di mutageni chimici. I ceppi di questo procariote più comunemente impiegati nel test di Ames contengono tutti una mutazione in uno dei geni che costituiscono l'operone per la biosintesi dell'istidina e inoltre hanno subito una serie di manipolazioni genetiche per essere ancora più sensibili all'azione dei mutageni. Esse consistono:
1.in una mutazione (rfa) che determina la sintesi di un componente lipopolisaccaridica lassa della parete batterica che rende la cellula permeabile a sostanze anche particolarmente voluminose (quindi aumenta la permeabilità ai mutageni);
2.nella delezione di una larga parte della sequenza nucleotidica comprendente i geni adiacenti uvrB e bio (gene coinvolto nella biosintesi della biotina), che elimina l'attività del sistema di riparazione per excisione e dà dipendenza alla biotina;
3.nell'introduzione del plasmide pKM101, che contiene un sistema di riparazione ricombinativa error-prone oltre a conferire resistenza all'ampicillina.
A questo punto per incorporare in piastra i ceppi, Ames utilizzò lo spot test. Questo metodo consiste nell'applicare una piccola quantità del mutageno al centro di una piastra contenente agar, nella quale sono stati piastrati i batteri. La sostanza diffonde dal centro verso la periferia della piastra formando un gradiente di concentrazione decrescente. Il mutageno determinerà quindi la formazione di un anello di colonie revertenti in funzione del medesimo gradiente. In questo test risultano essere molto importanti le dosi del mutageno. Infatti, qualsiasi sostanza mutagena viene saggiata in un range di almeno 8 concentrazioni in cui la massima concentrazione è limitata dalla solubilità della sostanza in un opportuno solvente. Comunque, per i composti non altamente tossici si accetta come dose più alta il valore arbitrario di 5 0 10 mg/piastra. Inoltre, ogni esperimento deve prevedere piastre di controllo negativo, in cui si testa il solvente usato (generalmente il dimetilsulfossido, DMSO) per sciogliere la sostanza test, e piastre di controllo positivo in cui vengono usati mutageni standard a una concentrazione nota. Il primo controllo serve per determinare la frequenza di reversione spontanea dei ceppi impiegati, da confrontare successivamente con i valori ottenuti a seguito del trattamento con il composto mutageno da saggiare. Il secondo tipo di controllo, invece, serve per verificare la capacità di reversione e la specificità di ogni ceppo e l'efficacia del sistema di attivazione metabolica. Quindi, alla fine del periodo di incubazione si conta, di ogni piastra, il numero delle colonie revertenti. All'osservazione microscopica il tappeto di crescita batterica, se normale, deve apparire formato da una fitta ed omogenea trama di cellule su cui spiccano nettamente ingrandite le colonie revertenti originate dalle successive divisioni. In presenza di tossicità e, man mano che questa aumenta, il tappeto di crescita si fa progressivamente meno fitto fino a diventare, in certi casi, completamente assente. A questo punto, un composto viene considerato mutageno se determina un incremento dose-dipendente del numero di revertenti spontanei in uno o più ceppi. Invece, non viene definito mutageno se non induce un aumento dose-dipendente del numero spontaneo di colonie revertenti di tutti i ceppi impiegati in almeno due esperimenti indipendenti.