Analisi di numerosità campionaria in esperimenti di espressione genica realizzati con i microarray

INTRODUZIONE 
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I IN NT TR RO OD DU UZ ZI IO ON NE E  
Le ricerche svolte negli ultimi anni nel campo della biologia molecolare e della 
genetica hanno reso possibile lo sviluppo e la commercializzazione di molteplici tecnologie 
per l’analisi delle molecole costituenti gli organismi viventi. In particolare, la messa a punto 
delle tecniche di amplificazione e sequenziamento del DNA ha aperto la strada ai progetti di 
mappatura del genoma, culminati nel 2003 con il sequenziamento completo del DNA umano 
nell’ambito dell’ambizioso Progetto Genoma Umano (Collins et al., 2003).  
Il risultato di questo progetto è stato la creazione di enormi banche dati che 
contengono le sequenze di tutti i geni e le informazioni ad esse correlate di molti organismi 
viventi e che possono essere utilizzate come vere e proprie mappe utili per lo studio e la 
comprensione dei processi cellulari. Questa immensa quantità di informazioni rappresenta la 
nuova, avvincente sfida dell’attuale era post-genomica. Infatti, il sequenziamento del genoma 
umano segna il passaggio dall’era pre-genomica, caratterizzata prevalentemente da studi di 
genomica strutturale (sequenziamento del genoma e mappaggio fisico dei geni) all’era post-
genomica, i cui sforzi principali si stanno focalizzando sempre più sull’individuazione della 
funzione che singoli geni o gruppi di geni svolgono nello sviluppo e nella vita degli organismi 
in generale e dell’uomo in particolare (genomica funzionale).  
La complessità e il volume di dati generati dai diversi progetti di sequenziamento 
hanno posto tuttavia serie limitazioni al tradizionale approccio di analisi, che prevedeva lo 
studio di un gene alla volta e ha richiesto lo sviluppo di metodiche di analisi simultanea di 
tutti (o quasi) i componenti di un sistema biologico. I microarray rappresentano un metodo 
per esaminare contemporaneamente e in maniera sistematica decine di migliaia di geni e in 
alcuni casi l’intero genoma di un organismo e promettono di diventare uno strumento di uso 
comune nella ricerca biologica e medica. 
I microarray per la valutazione dell’espressione genica permettono infatti di osservare 
come variano i profili di espressione di popolazioni di cellule o di tessuti biologici in diversi
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stadi di sviluppo, di malattia o di trattamento e di correlare tali osservazioni con i processi 
biologici esaminati. 
I microarray per studi di genotipizzazione consentono, invece, di determinare, in 
campioni di DNA provenienti da diversi soggetti, il profilo genetico relativo a un numero 
elevato di polimorfismi o addirittura, nel caso degli studi Genome Wide, a tutti i polimorfismi 
noti. Diventano quindi ottimi strumenti da utilizzare negli studi di associazione “casi-
controlli” in cui si va a confrontare la variazione della frequenza di polimorfismi genetici in 
due popolazioni a confronto, una con e l’altra senza un particolare fenotipo di interesse, al 
fine di correlare tali variazioni al fenotipo stesso (ad es. una malattia o la diversa risposta ad 
un trattamento farmacologico).  
I microarray, dunque, rappresentano la risposta ideale non solo alla crescente richiesta 
di saggi capaci di interrogare migliaia di geni in parallelo, ma soprattutto alla necessità di 
comprendere le reti di interazioni molecolari su scala globale. 
Si intravede facilmente l’immenso potenziale che questa tecnologia offre per 
rispondere a quesiti sia di tipo diagnostico/prognostico, relativi ad esempio alla 
classificazione dei tessuti o delle malattie su base genetica, che di indagine funzionale, ad 
esempio per lo studio delle caratteristiche funzionali, strutturali o di regolazione di geni 
sconosciuti o solo parzialmente noti.  
Tuttavia, per sfruttare l’enorme quantità di dati generata da queste tecnologie è 
fondamentale disporre di metodi di analisi efficaci. Questa necessità ha favorito la nascita di 
una nuova branca di ricerca, la bioinformatica, che oggi sta assumendo le caratteristiche di 
una vera e propria disciplina dopo quasi venti anni dai suoi albori negli anni ’80. 
 
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2005 2004 2003 2002 2001 2000
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Articles
Bioinformatics BMC  Bioinformatics
Journal of  Com putational  Biology Com putational  Biology  and Chem istry
Briefings  in  Bioinform atics IEEE Trans .  Comp. Biol. A nd  Bioinformatics
Applied  Bioinform atics PLoS Com putational  Biology
Int.J.of Bioinf. Res.& Appl.  (IJBRA)
 
Fig. 1: Aumento negli ultimi sei anni del numero di articoli nelle principali riviste di 
bioinformatica
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La bioinformatica si occupa dello sviluppo di strumenti informatici idonei alla gestione 
dei dati biologici (banche dati) e studia metodi e algoritmi per il trattamento e l’estrazione 
dell’informazione dagli stessi (programmi di analisi). 
Con l’avvento della tecnologia dei microarray, la genomica si avvia a diventare uno 
dei più importanti settori di applicazione della bioinformatica. Come vedremo meglio in 
seguito, illustrando le fasi di un esperimento microarray, conoscenze di bioinformatica 
entrano in gioco a tutti i livelli: dalla fase di progettazione, a quella di acquisizione e analisi 
dell’immagine, dal processo di estrazione dei dati alla loro analisi statistica ed interpretazione.  
 
 
Fig. 2: Fasi di un esperimento microarray 
 
 
Scopo della tesi 
 
Scopo della presente tesi è stato lo sviluppo di un algoritmo, in linguaggio R, per il 
calcolo della numerosità campionaria in un esperimento di class comparison per uno studio di 
espressione genica. 
La tesi si articola in sei capitoli. 
Il primo capitolo fornisce un’introduzione alla tecnologia dei microarray, illustrando 
brevemente le differenti piattaforme tecnologiche disponibili per la caratterizzazione dei 
profili di espressione genica (microarray a cDNA, microarray ad oligonucleotidi). Infatti, 
sebbene i microarray possano essere utilizzati anche per scopi diversi come la
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genotipizzazione, l’applicazione negli studi di espressione genica rimane quella attualmente 
più diffusa. 
Nel secondo capitolo vengono discussi alcuni importanti aspetti riguardanti la 
progettazione degli esperimenti che utilizzano i microarray, in relazione a quelli che sono gli 
obiettivi dello studio che si vuole realizzare. 
Il terzo e il quarto capitolo presentano le problematiche di natura statistica coinvolte 
nell’analisi dei dati generati dai microarray, con particolare riferimento agli esperimenti di 
“class comparison” in cui i microarray sono utilizzati per identificare quali geni risultano 
differenzialmente espressi in differenti condizioni sperimentali. 
Nel quinto capitolo viene esaminato uno dei problemi principali che si deve affrontare 
nella fase di progettazione di un esperimento microarray, vale a dire la scelta del numero di 
campioni o del numero di array necessari per poter osservare determinati risultati e i parametri 
statistici da cui essa dipende. Tale scelta è subordinata a quello che è riconosciuto come 
fattore limitante nell’esperimento; in particolare se il vincolo è rappresentato dal budget a 
disposizione, ciò che viene fissato è il numero massimo di array che si possono acquistare e 
da esso deriva il numero di campioni da collezionare. Viceversa, se il fattore limitante è dato 
dalla quantità di materiale biologico disponibile, si cerca di stabilire il numero di campioni 
minimo per conferire solidità statistica all’esperimento e da questo si ricava il numero di array 
da utilizzare. 
Nel sesto capitolo, dopo una breve descrizione delle funzioni che R (www.r-
project.org) e Bioconductor (www.bioconductor.org) mettono attualmente a disposizione 
degli utenti per il calcolo della numerosità campionaria, viene presentata la funzione 
appositamente ideata durante lo sviluppo di questa tesi. A differenza delle funzioni integrate 
nei vari pacchetti presenti sul mercato, che propongono una ristretta e rigida casistica di 
disegni sperimentali e un’interfaccia non facilmente gestibile da chi non ha sufficiente 
familiarità con il linguaggio di programmazione utilizzato, questa funzione è stata sviluppata 
nell’ottica di fornire uno strumento statisticamente robusto e fruibile anche da parte dei non 
“addetti ai lavori”.  
Infine, il settimo capitolo contiene le conclusioni e i possibili sviluppi futuri nella 
direzione di un miglioramento della funzione proposta per il calcolo della numerosità 
campionaria. Le eventuali modifiche cui si può pensare dovrebbero puntare in particolare ad 
una generalizzazione della funzione per renderla applicabile anche agli studi di “class 
comparison” con più di 4 classi o varietà a confronto e ad una quantificazione separata delle 
sorgenti di variabilità che indirettamente influiscono sul calcolo dell’ampiezza campionaria.
I MICROARRAY: TECNOLOGIA E APPLICAZIONI 
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1 1  I I  M MI IC CR RO OA AR RR RA AY Y: :  T TE EC CN NO OL LO OG GI IA A  E E  
A AP PP PL LI IC CA AZ ZI IO ON NI I  
1.1 GENERALITA’ 
I microarray a DNA rappresentano la più recente di una serie di tecniche che sfruttano 
le caratteristiche peculiari della doppia elica del DNA, ovvero la complementarità dei due 
filamenti e la specificità dell’accoppiamento delle basi.  
Nel 1975 E. Southern dimostrò che le molecole di acido nucleico marcate 
selettivamente potevano essere utilizzate per analizzare altre molecole di acido nucleico 
ancorate a supporti solidi come gel o filtri porosi (Southern, E. M., 1975). Il Southern blot 
rappresentò di fatto il primo array di materiale genico ed aprì la strada alla possibilità di 
analizzare i profili di espressione di un intero genoma attraverso l’accoppiamento 
(ibridizzazione) tra molecole di RNA messaggero (mRNA) e librerie di cDNA ancorate a 
supporti solidi. L’applicazione su larga scala di questa tecnologia si è però avuta più 
recentemente grazie all’utilizzo di supporti solidi non porosi, come il vetro, e alla messa a 
punto di tecniche fotolitografiche per la sintesi di oligonucleotidi ad alta densità spaziale. 
Negli anni ’80, R. P. Ekins e collaboratori del Dipartimento di Endocrinologia 
Molecolare dell’University College di Londra, furono i primi ad utilizzare le tecniche di 
microspotting per fabbricare array per saggi immunologici ad elevata sensibilità (Ekins, R. P., 
1987). Negli Stati Uniti, un contributo notevole è stato dato da P.A. Fodor e colleghi presso 
Affymetrix, Inc. (Santa Clara, California) (Fodor, S.P.A.; 1991), e da diversi gruppi di 
ricercatori dell’Università di Stanford, in particolare dall’équipe di P. Brown, del 
Dipartimento di Biochimica e Biofisica (Brown P.O. and Botstein D.; 1999). I protocolli 
sviluppati dal gruppo di Brown permettevano di depositare automaticamente su vetrini da 
microscopio ottico circa 10.000 filamenti di cDNA, di ibridizzarli a campioni di mRNA 
retrotrascritti in cDNA e marcati selettivamente con molecole fluorescenti e di seguire quindi 
le variazioni nei profili di espressione di colture cellulari in condizioni sperimentali diverse.
I MICROARRAY: TECNOLOGIA E APPLICAZIONI 
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Parallelamente, sfruttando le tecniche di mascheramento fotolitografico, normalmente 
utilizzate nell’industria dei semiconduttori, Fodor e i suoi collaboratori realizzarono il primo 
DNA microarray wafer-chip, noto come GeneChip ®, caratterizzato da oltre 400.000 sonde 
oligonucleotidiche su una superficie di un pollice quadrato. 
Dagli anni ‘90 ad oggi, un numero sempre maggiore di enti commerciali e gruppi 
accademici ha contribuito all’avanzamento nella tecnologia dei microarray. 
 
 
1.2 LA TECNOLOGIA DEI MICROARRAY A DNA 
Nella sua forma più generale un microarray è costituito da un substrato solido (vetro, 
plastica o silicio) sul quale possono essere immobilizzate centinaia o migliaia di molecole di 
varia natura in posizioni prefissate e denominate spot. Queste molecole possono essere acidi 
nucleici (DNA o RNA) o proteine (tipicamente antigeni o anticorpi), capaci di riconoscere e 
legarsi con molecole ad esse complementari. Essi permettono di eseguire, pertanto, reazioni di 
ibridizzazione, nel primo caso, o interazioni immunologiche, nel caso dei protein-microarray.  
Per comprendere il principio di funzionamento dei microarray a DNA e  la tipologia di 
informazioni che il loro utilizzo rende disponibili, in particolare negli studi di espressione 
genica, è indispensabile fare una breve premessa di carattere biologico.  
 
1.2.1 Principi di biologia molecolare alla base dei microarray a DNA 
Tutte le cellule di un organismo, dal più semplice al più complesso, contengono una 
copia identica dell’intero genoma sotto forma di molecole di DNA. Cellule dello stesso 
organismo, tuttavia, possono differire le une dalle altre sia dal punto di vista morfologico che 
funzionale. Queste differenze sono determinate da una diversa espressione dei geni. Il modo 
più corretto per sapere quali geni sono espressi da una cellula è identificare le proteine 
presenti al suo interno. Nella pratica però, data l’elevata instabilità delle proteine e la 
necessità di utilizzare metodi di identificazione immunologici molto costosi, questo approccio 
risulta di difficile attuazione. Più semplice è lo studio delle molecole di RNA messaggero 
(mRNA) che funzionano da stampo per la sintesi delle proteine (fig.1.1), vale a dire lo studio 
del trascrittoma delle cellule. La corrispondenza tra molecole di mRNA e proteine, in realtà, 
non è perfetta, perché non tutti i trascritti vengono necessariamente tradotti, alcuni sono 
eliminati prima di funzionare da stampo per la sintesi proteica. Il trascrittoma, tuttavia, può 
essere considerato sufficientemente rappresentativo del proteoma di una cellula, e quindi dei 
geni espressi da quella cellula, dal momento che, nella maggior parte dei casi, la decisione se 
esprimere o no un dato gene viene attuata prima del processo di trascrizione. 
L’analisi del trascrittoma consente quindi di identificare i geni che una cellula sta 
esprimendo in un dato momento in modo da poter correlare tale informazione con il fenotipo, 
morfologico o funzionale, della cellula stessa.
I MICROARRAY: TECNOLOGIA E APPLICAZIONI 
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Fig 1.1: Direzione del flusso delle informazioni genetiche 
In quest’ottica i microarray a DNA hanno rivoluzionato il modo in cui si studia oggi 
l’espressione genica, permettendo di analizzare con un solo esperimento tutti gli RNA 
trascritti da un campione biologico di interesse, ad esempio un clone di cellule o un 
frammento di tessuto.
I MICROARRAY: TECNOLOGIA E APPLICAZIONI 
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Fig. 1.2: Meccanismo di ibridizzazione degli acidi nucleici 
 
1.2.2 Descrizione di un esperimento microarray 
Fisicamente i microarray a DNA sono costituiti da un supporto in vetro o silicio, su cui 
sono ancorate decine di migliaia di sequenze nucleotidiche, chiamate sonde, rappresentative 
nel loro insieme di tutte le sequenze espresse dal genoma di un dato organismo. 
Il principio su cui si basano i microarray a DNA è dato dalla specificità con cui 
ibridizzano due sequenze nucleotidiche complementari. Una sequenza, la cui estremità è 
fissata al supporto, funge da sonda per l'identificazione dell'altra (il target) che corrisponde ad 
uno specifico mRNA. 
Nell’analisi dei profili di espressione genica, tipicamente vengono confrontati due 
campioni (es: controllo/trattato, cellule sane/malate, cellule di un tipo/cellule di un altro 
tipo,…).  
Sperimentalmente la procedura prevede l’estrazione dell’RNA dalle cellule di interesse, 
che deve essere il più possibile di ottima qualità, ossia puro e integro. 
La verifica della purezza viene effettuata mediante lettura spettrofotometrica a 260 nm 
(lunghezza d’onda alla quale assorbono gli acidi nucleici), a 280 nm (lunghezza d’onda alla 
quale assorbono le proteine) e a 230 nm (lunghezza d’onda alla quale assorbono le sostanze
I MICROARRAY: TECNOLOGIA E APPLICAZIONI 
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organiche). Rapporti di assorbimento 260/280 e 260/230 maggiori di 2 sono indice di un RNA 
sufficientemente purificato da proteine e da sostanze organiche contaminanti. 
Per quanto riguarda l’integrità dell’RNA essa può essere verificata o mediante corsa 
elettroforetica su gel di agarosio (metodica classica) oppure facendo ricorso a strumenti più 
sofisticati come il Bioanalyzer, che, grazie ad un sistema di corsa elettroforetica capillare e ad 
un software di analisi, attribuisce a ciascun campione un valore numerico, il cosiddetto RIN 
(RNA Integrity Number), indicativo dell’integrità dell’RNA.  
A partire dall’RNA totale estratto dai campioni in esame, solo le molecole di RNA 
messaggero vengono retrotrascritte in cDNA (DNA complementare), grazie all’impiego di 
primer di innesco per la trascrittasi inversa poli-T, complementari alle code di poli-A degli 
mRNA. Le sequenze di cDNA ottenute vengono successivamente marcate con molecole 
fluorescenti. La soluzione contenente le sequenze marcate viene poi depositata sul vetrino, in 
modo da consentire l’ibridizzazione fra sonde e molecole “target”. 
In relazione al tipo di marcatura e di ibridizzazione è possibile distinguere due 
protocolli sperimentali indicati in letteratura come “one-color” e “two-color”. 
La procedura “one-color” prevede l’ibridizzazione di un singolo campione su ogni 
array (ibridizzazione assoluta) e l’utilizzo di un solo tipo di fluorocromo. 
Al termine dell’ibridizzazione l’array, opportunamente lavato per eliminare le 
sequenze legate in maniera non specifica, viene quindi esposto a una sorgente di luce laser di 
lunghezza d’onda tale da fornire energia e indurre la fluorescenza delle molecole di marcatore. 
Le intensità di segnale emesse dai vari spot vengono acquisite dalla matrice a CCD di uno 
scanner e tradotte in immagine. L’intensità di uno spot è proporzionale al numero di molecole 
di fluorocromo presenti su di esso e quindi al numero di molecole di acido nucleico che si 
sono ibridizzate con la sonda ancorata al supporto. In questo caso, il dato di intensità fornisce 
una misura assoluta della quantità di mRNA presente nel campione, cioè del livello di 
espressione del gene corrispondente.  
Quanto detto implica che negli esperimenti “one-color” sono necessari due vetrini per 
poter confrontare i livelli di espressione dei geni nelle due condizioni di interesse. Questo 
confronto può essere soggetto ad errore a causa di differenze nella forma degli spot 
corrispondenti sui due array. 
Il protocollo “two-color” si basa, invece, sull’utilizzo di due campioni di mRNA 
diversi marcati con due fluorocromi differenti (tipicamente il rosso e il verde) e ibridizzati 
sullo stesso array. Questo tipo di ibridizzazione è detta competitiva poiché i due target 
competono per il legame con le sonde. Dopo l’ibridizzazione si procede alla scansione del 
vetrino utilizzando uno scanner a doppio canale in grado di eccitare distintamente i due 
fluorocromi ed acquisire separatamente i segnali da essi emessi. Si producono in questo modo 
due immagini sovrapponibili costituite da una matrice di spot fluorescenti, ognuno 
corrispondente ad un gene diverso, le cui intensità sono proporzionali al numero di molecole 
target ibridizzatesi con le sonde sul vetrino. Il rapporto fra le intensità di fluorescenza del 
rosso e del verde, denominato “fold-change”, è una misura della concentrazione relativa di
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ogni mRNA nei due campioni a confronto. Spot tendenti al giallo indicano una uguale 
espressione dei geni corrispondenti nei due campioni; spot tendenti al verde o al rosso 
indicano una aumentata espressione in un campione rispetto all’altro.  
Rispetto alla procedura “one-color”, il protocollo “two-color” consente di eliminare gli 
errori dovuti alla forma diversa degli spot su array distinti dal momento che entrambi i 
campioni sono ibridizzati sugli stessi spot. 
 
 
Fig. 1.3: Schema di un esperimento “two-color” 
 
1.2.3 Tipologie di microarray 
1.2.3.1 “Spotted” Array 
Nei microarray di questo tipo le sonde sono costituite da molecole di cDNA di 
lunghezza compresa tra le 200 e le 400 paia di basi, amplificate mediante PCR (Polymerase 
Chain Reaction) e successivamente depositate sul vetrino. 
Le sonde vengono scelte direttamente da banche dati genomiche (GenBank, dbEST, 
UniGene), benché sia possibile usare anche librerie proprietarie costituite da cDNA non 
ancora completamente sequenziato.  
Le sonde sono fissate al vetrino per deposizione meccanica mediante un braccio 
robotico che preleva le sonde a doppio filamento direttamente da piastre da 96 o da 384 
pozzetti, utilizzate per la PCR, attraverso un sistema di pennini, e ne deposita quantità 
microscopiche (dell’ordine di 100-500 μg/mL) sulla superficie del vetrino. In questo modo si