Approcci genetici e funzionali nello studio delle leucemie linfoblastiche acute LLA

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1.INTRODUZIONE 
1.1 Cellule staminali, cellule progenitrici e precursori cellulari  
Tutte le cellule del sangue derivano da cellule staminali emopoietiche pluripotenti 
(PHSC), che rappresentano circa lo 0,1% delle cellule nucleate del midollo osseo. 
Queste di solito sono quiescenti, ma possono andare incontro ad attività mitotica, 
producendo sia altre cellule pluripotenti che due tipi di cellule staminali 
emopoietiche multipotenti. 
Queste due popolazioni sono responsabili della formazione delle varie cellule 
progenitrici Una di queste, detta colony-forming unit-S (CFU-S) è precursore delle 
cellule della linea mieloide (eritrociti, granulociti, monociti e piastrine), mentre l’altra 
detta colony-forming unit-Ly (CFU-Ly) è precursore delle cellule della linea linfoide 
(cellule B e T). 
Le cellule staminali del midollo osseo si trovano generalmente nello stadio G0 del 
ciclo cellulare, ma possono essere guidate nello stadio G1 da molti fattori di crescita e 
citochine. L’emopoiesi infatti è regolata da numerosi fattori di crescita prodotti da 
vari tipi cellulari. Ogni singolo fattore di crescita agisce su una particolare cellula 
staminale o progenitrice o precursore e ne induce la proliferazione o la 
differenziazione o ambedue i processi. Le cellule più immature di entrambe le serie 
vengono dette “blasti”ed in condizioni normali sono meno del 5 % di tutte le cellule 
midollari. (Gartner L.P. et al., 2004) 
 
1.2 Le malattie linfo-mieloproliferative 
Le malattie Linfo-Mieloproliferative rappresentano un gruppo eterogeneo di 
patologie caratterizzato dall’espansione clonale di cellule ematopoietiche (linfoidi o 
non-linfoidi) a livello del midollo osseo, degli organi linfoidi secondari o in sedi 
extranodali. Si distinguono forme solide (linfomi), circa 10 volte più frequenti, e 
forme midollari/ematiche (leucemie), sia linfoidi che non-linfoidi (c.d. 
mieloidi)(Larizza et al., 1991) (fig.1).
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1.3 Le leucemie 
Le leucemie costituiscono un ampio ed eterogeneo gruppo di neoplasie maligne del 
tessuto emolinfopoietico che hanno origine da una cellula staminale non ancora 
orientata o in precursori orientati in senso mieloide o linfoide (Widman et al., 2002). 
La trasformazione neoplastica altera i meccanismi che regolano la proliferazione e la 
differenziazione della cellula staminale colpita (Cline MJ et al., 1994), la conseguenza 
è l’origine di un clone neoplastico che si accumula primariamente nel midollo osseo e 
poi in altri organi e tessuti, caratterizzato da una proliferazione afinalistica e 
incontrollata tale da acquisire più o meno rapidamente una netta prevalenza 
numerica rispetto ai cloni normali (Mandelli F. et al., 1991).  
Nelle forme acute si osserva una perdita della capacità di differenziazione e alla 
proliferazione di blasti altamente immaturi, mentre nelle forme croniche si ha 
soprattutto un aumento numerico di cellule che presentano caratteristiche 
morfologiche e maturative simili alle cellule normali (Rabbits TH. et al., 1991). 
Quando le cellule interessate nel processo leuchemiogenico hanno caratteristiche 
fenotipiche (citologiche e molecolari) linfoidi si parla di leucemie linfoidi o sindromi 
linfoproliferative. Quando le cellule neoplastiche hanno caratteristiche fenotipiche 
mieloidi si parla di leucemie mieloidi. 
Le leucemie linfoidi, in grandissima maggioranza originano da cellule staminali la 
cui differenziazione è già stata determinata in senso linfoide, sia dal punto di vista 
biologico che dal punto di vista clinico. Una parte delle leucemie mieloidi invece 
origina dalla trasformazione neoplastica di una cellula staminale la cui
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differenziazione non è stata ancora determinata. Esse si chiamano ugualmente 
mieloproliferative perché la loro progenie è costituita prevalentemente da cellule 
neoplastiche con caratteristiche mieloidi; o da cellule staminali emolinfopoietiche. 
Questo spiega perché alcune sindromi mieloproliferative possano talora produrre 
cellule neoplastiche con fenotipo linfoide (un classico esempio è dato dalla leucemia 
mieloide cronica) e perché talune leucemie acute possono essere fenotipicamente 
ibride. (Sante Tura 1997). Sia le leucemie linfoidi che quelle mieloidi si distinguono a 
loro volta in sottotipi a seconda della linea (per esempio B o T, granulocitaria, 
eritroide o megacariocitica)o a seconda del grado di mutazione fenotipica espressa 
oltre che in termini morfologici e immunofenotipici anche in termini molecolari. 
Questo si verifica o perché le neoplasie hanno origine da cellule staminali che hanno 
una collocazione ontogenetica diversa, oppure dalla medesima cellula staminale  che 
subisce diverse trasformazioni in senso neoplastico.  
Esistono, inoltre, casi meno frequenti in cui l’espansione clonale leucemica presenta 
aspetti fenotipici promiscui, sia mieloidi che linfoidi, e si parla, pertanto, di leucemie 
ibride o bifenotipiche (Pui CH. et al., 1984; Lo Coco F. et al.,1991).  
 
1.4 La classificazione delle Leucemie mieloidi acute (LMA) 
La classificazione delle LMA si basa su criteri morfologici mediante l’osservazione 
microscopica di strisci di sangue periferico e di midollo osseo, e su criteri citochimici 
mediante l’analisi di attività enzimatiche e/o presenza di particolari sostanze 
(mieloperossidasi, sudan nero, fosfatasi acida etc.) sui blasti leucemici.
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Tali criteri furono stabiliti nel 1976 e rivisti nel 1985 dal gruppo FAB (Gruppo 
Cooperatore Francese-Americano-Britannico) (Bennet JM. et al., 1976). 
Tale sistema, che prevede indagini relativamente semplici e facilmente riproducibili, 
ha trovato largo impiego in tutto il mondo ed ha permesso di superare preesistenti 
divergenze classificative, poiché consente una certa omogeneità di interpretazione. 
Secondo questo sistema di classificazione, per porre diagnosi di leucemia acuta 
mieloide, occorre che il numero di blasti mieloidi nel midollo sia più del 30%, con più 
del 3% positivi alla tecnica citochimica con Sudan Nero (SBB) od a quella per 
evidenziazione della Mieloperossidasi (MPO)(E-Oncology. 2004). 
Nel gruppo della LMA possono essere coinvolti vari tipi cellulari, così da poter 
distinguere in questa categoria 8 differenti sottotipi secondo al Classificazione FAB 
(Tab.1). 
•M0 (indifererenziata): caratterizzata da blasti privi di granuli citoplasmatici e corpi 
di Auer.  
Le reazioni citochimiche convenziona convenzionali (MPO e SBB) risultano negative.  
Per la diagnosi deve essere rilevata la positività per uno o più marker mieloidi 
(antigeni CD13 e CD33)in almeno il 20% dei blasti leucemici. Non è associata ad 
alterazioni citogenetiche specifiche. 
•Leucemia acuta M1: (senza maturazione) caratterizzata da blasti mieloidi senza 
segni di maturazione.
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Non sono presenti granuli citoplasmatici; la cromatina nucleare è fine. Per la diagnosi 
è necessario evidenziare la positività alla MPO ed al SBB in almeno il 30% dei blasti 
leucemici. 
La componente granulocitaria, con segni di maturazione, deve essere inferiore all’1%. 
Non è associata ad alterazioni citogenetiche specifiche. 
•Leucemia acuta  M2 con maturazione: caratterizzata da blasti mieloidi nei cui 
citoplasmi è possibile osservare granuli azzurrofili  di Auer, ben evidenti i nucleoli.  
La componente monocitaria acuta con segni di  maturazione è superiore al 10%; la 
componente monocitaria deve essere inferiore al 20%. 
Questi sottotipi si associano alla traslocazione traslocazione (8;21) [t(8;21)] con il 
coinvolgimento di geni AML/ETO, con una prognosi favorevole.  
•Leucemia promielocitica acuta M3: la quasi totalità delle cellule leucemiche è 
costituita da promielociti atipici con citoplsma ricco di granulazioni azzurrofile e 
corpi di Auer (variante ipergranulare). 
Questo sottotipo è associato con altissima frequenza alla t (15;17) e al 
riarrangiamento genico PML/RAR  con prognosi favorevole. Esiste una variante 
ipergranulare in cui i granuli non sono visibili alla microscopia ottica ma solo 
dimostrabili con la microscopia elettronica. L’alterazione citogenetica è la stessa della 
variante ipergranulare. 
•Leucemia acuta M4 (mielomonocitica): per la diagnosi di questa forma deve essere 
presente: una quota di blasti superiore al 20%, una componente granulocitaria
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midollare nei vari stadi differenziativi maggiore del 20% ed una componente 
monocitaria midollare non inferiore al 20%. 
La positività per la mieloperossidasi e la cloro-acetato-esterasi (esterasi non 
specifiche) viene riscontrata nella componente granulocitaria ed è presente nelle 
cellule monocitarie la netta positività all’ -naftil-acetato esterasi (ANAE). 
L’inversione del cromosoma 16 (inv 16), con prognosi favorevole, si associa 
frequentemente ad una variante delle AML M4 eosinofilia. Gli eosinofili sono 
abnormi nel citoplasma. 
•Leucemia Acuta M5a (monolitica scarsamente differenziata): le cellule 
monoblastiche devono costituire almeno l’80% delle cellule leucemiche; la 
componente granulocitaria, se presente, deve essere inferiore al 20% delle cellule 
leucemiche. I monoblasti sono negativi alle mieloperossidasi e positivi all’ ANAE. 
Questa forma non è associata ad alterazioni citogenetiche specifiche.  
• Leucemia Acuta M5b leucemia monolitica con differenziazione: per la diagnosi è 
necessario che i monoblasti siano meno dell’80% della componente monocitaria. 
•Leucemia Acuta M6 (eritroleucemia): è caratterizzata dalla coesistenza di blasti 
mieloidi ed eritroblasti abnormi nunericamente a livello del midollo osseo. I 
precursori eritroidi sono meno del 50% delle cellule; almeno il 30% delle cellule non 
eritroidi è costituito da mieloblasti; i precursori eritroidi sono displastici e PAS 
positivi. Le alterazioni citogenetiche sono estremamente variabili. 
•Leucemia Acuta M7 (megacariocitaria): la diagnosi di questa forma leucemica è 
esclusivamente immunofenotipica: gli elementi blastici devono essere sempre