Valutazione del livello di ossidazione delle proteine di hamburger addizionati con fenoli estratti dalle acque di vegetazione del frantoio

Nel campione di controllo crudo nella figura 55 si osserva la linearità nel tempo dell’ossidazione. Al diminuire dei gruppi sulfidrilici i gruppi carbonilici aumentano in maniera costante.
Con la cottura sembrerebbe venir meno il rapporto di proporzionalità inversa che si ha nel campione crudo (figura 56), nel campione di controllo, con la cottura si nota un generale dimezzamento del livello di sulfidrili al tempo 0 e al tempo 5, mentre al tempo 8 sembra arrestarsi. Il livello dei carbonili aumenta di circa 4 volte con la cottura al tempo 0, mentre i osserva una stasi al tempo 5 ed una loro leggera riduzione al tempo 8.
Nella tesi L1 (figura 57) sembrerebbe che il rapporto di proporzionalità inversa tra Carbonili e Sulfidrili sia ancora presente, anche se in modo meno marcato rispetto al controllo Crudo.
Con la cottura di L1 (figura 58) si osserva al tempo 0 un dimezzamento dei sulfidrili, che procede fino al tempo 5 e si arresta al tempo 8. Per quanto riguarda i carbonili questi non sembrano essere influenzati dalla cottura, rimanendo costanti dal tempo 0 al tempo 8.
Nel caso di L2 (figura 59) il rapporto di proporzionalità inversa si ha tra il tempo 0 e 5, tuttavia si osserva lo strano fenomeno di aumento dei sulfidrili dal tempo 5 al tempo 8.
Dopo la cottura (figura 60) L2 si presenta con i livelli di sulfidrili quasi dimezzati al tempo 0 e 8, mentre rimangono costanti al tempo 5. I carbonili aumentano di circa il 50% con la cottura al tempo 0 e 5, mentre al tempo 8 sembrerebbero non aumentare.

Sembrerebbe che il metodo funzioni correttamente su campioni freschi che non siano in stato avanzato di ossidazione (come si è visto in precedenza il rapporto di proporzionalità inversa è costante nel campione di controllo crudo rispetto a quello cotto).
I polifenoli sembrerebbero agire su questo rapporto posticipando l’ossidazione delle proteine nel caso della tesi L1, impedendo l’innalzamento del livello di carbonili e mantenendo costante il livello di sulfidrili. Al contrario con la tesi L2 sembrerebbe esserci un’azione pro-ossidante sulle proteine a carico dei carbonili, ciò potrebbe essere collegato ad un’interferenza durante le analisi dei carbonili data dagli stessi polifenoli. Questa interferenza sembrerebbe più visibile nei campioni della tesi L2 che presentano, a parità di metodica, una deviazione standard rispetto alla media di molto maggiore rispetto ai campioni della tesi L1 e dei campioni di con- trollo. Al contrario la metodica per la determinazione dei gruppi sulfidrilici sembrerebbe meno incline ad errore, tuttavia l’aggiunta di fenoli sembrerebbe ridurre già dal tempo 0 il livello di sulfidrili sia per L1 che per L2.
Dal punto di vista dell’ossidazione, secondo Elias et al., (2008) mentre il rapporto tra ambiente anti-ossidante e pro-ossidante nei tessuti biologici viene normalmente controllato per mantenerne costante il livello, questo non si ha negli alimenti. Le lavorazioni aumentano lo stress ossidativo introducendo ossigeno tramite operazioni come:
• La macinazione, il rimescolamento e l’omogeneizzazione;
• La rimozione degli antiossidanti naturalmente presenti nell’alimento (il calore denatura gli enzimi e le proteine ad azione antiossidante)
• La liberazione di ioni metallici (il ferro presente nella mioglobina favorisce l’ossidazione).
La cottura è tra le principali cause della distruzione delle membrane e provoca il rilascio di sostanze pro-ossidanti, come per esempio ferro non eme, che accelera i processi ossidativi. (Botsoglou et al., 2013). La formazione dei carbonili è ferro-dipendente e può sfruttare la presenza di aminoacidi liberi, zuccheri riducenti o prodotti non ossidati degli acidi grassi polinsaturi (Estevez, 2011). I tioli invece sono suscettibili sia al calore che al contenuto di ferro presente nell’alimento. La cisteina, presente sotto forma di residui nel muscolo post- mortem, è molto sensibile all’ossidazione rispetto agli aminoacidi che producono carbonili. (Promeyrat et al., 2013). I principali tioli presenti nelle cellule muscolari, oltre alla cisteina, riguardano proteine come il glutatione, l’acido diidrolipoico e l’ergotioneina. Queste proteine in ambiente pro-ossidante tendono a reagire con lo stato più ossidato della metamioglobina chiamato ferrimioglobina (il ferro del gruppo eme ha numero di ossidazione +3 e il sito di legame con l’ossideno è occupato dall’acqua) formando radicali tiolici pro-ossidanti. (Romero et al., 1992).

Nei campioni crudi non si ha lo stesso ambiente pro-ossidante che si ha durante la cottura, ma bensì si tratta di una matrice il cui bilanciamento tra ambiente anti-ossidante e pro-ossidante può essere spostato a favore di quello antiossidante. L’aggiunta di fenoli vegetali negli hamburger ha portato, come osservato nei risultati ottenuti, ad un aumento dell’ossidazione di questi ultimi. Un contenuto elevato in fenoli viene normalmente collegato ad una maggiore capacità antiossidante, tuttavia, in contrasto con quest’ultima ipotesi i polifenoli vegetali hanno anche il potenziale per agire come pro-ossidanti sotto certe condizioni (Nieto et al., 2010) e tendono a reagire con le componenti del cibo quando si trovano sotto forma di radicali fenolici o chinoni. (Fujimoto & Masuda, 2012)
Nella figura 61 viene mostrato come si formano i chinoni (radicali liberi dei polifenoli) a partire da un acido fenolico. L’acido fenolico viene rotto tramite polifenolo ossidasi o in presenza di ambiente alcalino portando alla formazione di un chinone che risulterebbe altamente reattivo con proteine ed aminoacidi. Ciò porta a pensare che i polifenoli possano interagire anche con le altre componenti nutritive presenti negli alimenti, compresi carboidrati, lipidi ed acidi nucleici.
Nel caso delle proteine, ci sono molti documenti che ne descrivono l’interazione con i polifenoli. Studi in vitro hanno dimostrato che queste ultime avvengono perlopiù tramite legami idrofobici non covalenti che potrebbero successivamente stabilizzarsi tramite legami ad idrogeno (Yuksel et al., 2010). I legami non covalenti inclusi riguardano anche le forze di Van der Waals, il ponte ad idrogeno e il legame ionico. Rispetto ai legami covalenti questi ultimi sono più deboli e sono sempre reversibili, permettendo alla proteina di poter tornare al suo stato originario (Nagy et al., 2012). I legami covalenti sono al contrario il risultato di un’associazione irreversibile tra le proteine e i polifenoli, dove i polifenoli vengono trasformati in chinoni che, come spiegato precedentemente, potrebbero successivamente reagire con i gruppi presenti nelle molecole proteiche (Beart, Lilley, & Haslam, 1985). Ciò che potrebbe influenzare la formazione e il tipo di legame dei composti polifenolo-proteici riguarda il peso molecolare, la flessibilità strutturale e il numero di gruppi ossidrili (OH) presenti nella molecola polifenolica. E’ stato dimostrato che i polifenoli ad alto peso molecolare come i tannini sono maggiormente capaci di legarsi in maniera più forte alle proteine, mentre i polifenoli a basso peso molecolare tendono a formare legami più deboli, a meno che non vengano trasformati in chinoni. (Frazier et al.,2010). Con la formazione del legame polifenolo-proteina si potrebbe ottenere un composto proteico di ridotta qualità nutrizionale, dovuta dalla diversa struttura proteica in cui si presentano i siti deboli di legame sulla sua superficie, con possibile ripiegamento della stessa e variazione della sua funzionalità. (Yuksel et al., 2010).
Questo cambiamento di funzionalità potrebbe anche interferire con l’assorbimento di alcuni aminoacidi essenziali come lisina, triptofano e cisteina. Quest’ultima, assieme al glutatione, rappresenta uno degli aminoacidi necessari per ridurre l’ossidazione delle molecole biologiche, ne consegue che probabilmente l’aggiunta di polifenoli in quantità elevate vadano a saturare i siti di legame e ne riducano le capacità antiossidanti. (Jakobek L., 2015)
Da un lato la formazione di legami reversibili dati da legami covalenti porterebbe a far pensare che i polifenoli agiscano come antiossidanti impedendo alle specie reattive dell’ossigeno di reagire direttamente con i siti di legame delle proteine, ossidandosi al loro posto in presenza di perossidi. Dall’altro la presenza di enzimi come le polifenolo ossidasi, gli ambienti alcalini e /o la presenza di polifenoli a basso peso molecolare sembrerebbero portare alla formazione di radicali liberi, che si legherebbero tramite legame covalente ai gruppi amminici e sulfidrilici delle proteine ossidandole a loro volta e rendendole non più biodisponibili (Hurrel & Finot, 1984) questo legame viene mostrato dalla riduzione di gruppi tiolici liberi che si osserva nelle figure 51 e 52. Inoltre il cross-link proteico porterebbe anche ad una ridotta suscettibillità all’idrolisi enzimatica rendendo il legame di difficile separazione e con la formazione di colorazioni indesiderate. (Matheis & Whitaker, 1983)