Sequenziazione degli acidi nucleici

Taglio chimico: separazione più limitata attraverso enzimi che porta a risultati confrontabili con altre tecniche; vengono promossi tagli in posizioni riconoscibili.

Il dimetilsolfossido a pH ≥ 7 è un agente selettivo per G, metilandola in 7.

Se pH < 3oltre a G, viene metilata anche A in 3N, carica positiva trasferita in 9 e taglio.

L’idrazina fa un attacco nucleofilo sulle pirimidine in 4 e 6 staccando le posizioni 1, 2, 3; si forma l’urea (sottoprodotto) e l’N dell’idrazina forma un nuovo eterociclo (pinazolo sostituito), che distacca la purina con 1C che si libera in forma cationica; è possibile guidare il taglio attraverso I.

Taglio selettivo a I molto alta e riguarda solo C: effetto di I sui cambiamenti di assetto conformazionale.

Soluzione di piperidina sul catione: 1N dà attacco nucleofilo sul desossiribosio, promuovendo il distacco dei residui fosforici attraverso una forma tautomerica; si forma una popolazione di frammenti di varia lunghezza tagliati in posizioni diverse a partire da un unico filamento.

Per le separazioni elettroforetiche, è necessario rendere visibile un terminale: si usa l’ATP e un enzima specifico; fanno una reazione specifica prelevando il fosforile γ dall’ATP e mettendolo sul terminale 5’.

Si può usare γP radioattivo, trasferendo su γP una molecola fluorescente. Esaminando la banda cromatografica si vede il materiale marcato, e lo si divide in 4 aliquote ognuna in una condizione diversa. Si ottengono segmenti più o meno lunghi, riconoscibili nel percorso elettroforetico (gel calibrato in modo da discriminare lunghezze di un solo nucleotide): accoppiando migrazione e posizione nella sequenza di migrazione si può ricostruire la sequenza.

La lettura viene fatta tenendo conto della velocità di spostamento (a maggiore q/m per minore lunghezza, si ha una migrazione più lunga). Se si considera la posizione di massima migrazione come posizione 1, andando a zig-zag si possono riconoscere le posizioni.