Resintesi

Vengono usate quattro tipi di resina a seconda delle sintesi; per impaccare la colonna cromatografica (in ambiente anidro) si usa la carbodiimmide in forma cicloesil (massima apolarità, massima solubilità).

I nucleotidi protetti in 5’ si legano in 3’ con il derivato fosfoammidico che ha P trivalente.

Attraverso pompe si fanno arrivare sulla colonna di sintesi l’una o l’altro.

Al 1° lavaggio viene eliminato l’ultimo nucleotide e il fattore di protezione. Si fa quindi arrivare nella miscela con la carbodiimmide il penultimo nucleotide. La carbodiimmide diventa urea, attivando il fosfoderivato e rimuovendo la struttura amminica dal P, in modo che riceva attacco nucleofilo dal gruppo in 5’ dall’ultimo nucleotide legato alla resina, con formazione di un legame fosfodiestereo con P trivalente.

Il ciclo di reazione viene completato con un altro lavaggio che rimuove CH3OH dal fosfato, e da un ultimo lavaggio con una soluzione di alogenuro che ossida P(III) a P(V).

Il ciclo riparte, la sintesi continua fino a un centinaio di elementi formando catene “sonde”, che sono abbastanza brevi da non avere struttura secondaria e supersecondaria, ma sono in grado di complementarsi con sequenze analoghe (la sequenza delle basi è loro complementare). Le sonde vengono marcate in 5’ con un cromoforo o con P radioattivo e si fa il confronto con la sequenza in esame. L’unione per appaiamento complementare tra sonda e polinucleotide incognito è conosciuto come ibridazione (perfetta se si ha massima resa in fluorescenza o in marcatura; se le sequenze non sono perfettamente complementari ci sono zone impilate).

La sintesi serve per migliorare la precisione analitica o per capire se le sequenze hanno una percentuale di analogia (valore accettato se si ha un risultato tra il 30 e il 70%).