Le costrizioni secondarie: le regioni organizzatrici del nucleolo

Oltre al centromero come costrizione primaria, esistono altre regioni cromosomiche, soprattutto negli eucarioti superiori, note con il nome di costrizioni secondarie. Queste sono regioni che non riescono ad effettuare la normale condensazione cromosomica, vale a dire che durante la G2 appaiono in mitosi e, quindi al microscopio ottico, come delle regioni meno dense e cioè presentano un aspetto più diffuso dei cromosomi in metafase. Esse non sono presenti su tutti i cromosomi ma sono caratteristiche di ogni cariotipo di una determinata specie.
LE REGIONI ORGANIZZATRICI DEL NUCLEOLO (NORs)
Le regioni che sono state per prima caratterizzate come costrizioni secondarie sono le regioni organizzatrici del nucleolo (NORs). Quest'ultime sono la sede dei geni che codificano per gli RNA ribosomiali (rRNA) e cioè, negli eucarioti superiori, 18S, 5.8S e 28S. Esiste anche un altro rRNA, noto come 5S, che non è presente nelle regioni organizzatrici del nucleolo, fondamentale per la costituzione dei ribosomi ma non si trova insieme agli altri geni elencati prima. Ognuna di queste regioni, i NORs, corrisponde a un cluster di geni di rDNA ripetute in tandem. Nel cariotipo umano le regioni organizzatrici del nucleolo si trovano in corrispondenza delle cinque coppie di cromosomi acrocentrici: gruppo D (numero 13, 14 e 15) e gruppo G (numeri 21 e 22). Inoltre, la costrizione secondaria è subtelomerica e la parte superiore del cromosoma viene chiamata satellite cromosomico. In generale, si ha una differenza tra l'organizzazione del cluster ribosomiale nei batteri e quello negli eucarioti. Nel primo caso, partendo dal 5' abbiamo il gene per l'rRNA 16S, uno spaziatore interno nel quale ci si ritrovano uno o due geni per RNA transfer (tRNA), il gene per l'rRNA 23S, un altro spaziatore interno, il gene per l'rRNA 5S, un ulteriore spaziatore e infine il terminatore al 3'. Tutti questi geni vengono trascritti insieme per poi essere processati sino a dare gli rRNA maturi: 16S, 23S e 5S.
Negli eucarioti superiori, invece, troviamo, sempre partendo dal 5', un unità ripetuta di rDNA che contiene uno spaziatore esterno non trascritto NTS, uno spaziatore interno trascritto ETS, poi il gene per l'rRNA 18S, uno spaziatore interno trascritto ITS, gene per l'rRNA 5.8S, spaziatore interno trascritto, il gene per l'rRNA 28S e infine al 3' un ulteriore spaziatore esterno trascritto, ETS (ricordiamo che questa, appena descritta, è un unità ripetuta, in Xenopus laevis 450 copie, in Drosophila 150 copie sui cromosomi sessuali e nell'uomo 30-50 copie sui cromosomi acrocentrici). Quindi abbiamo il processamento che inizia con la trascrizione dell'RNA dallo spaziatore esterno trascritto, ETS, la formazione di un pre-rRNA 20S a seguito di  un taglio nella regione ITS al 5' del gene per l'rRNA 5.8S, e successivamente l'eliminazione di un altra parte che porterà all'espressione del 18S maturo. Contemporaneamente l'altra parte dell'RNA forma un loop, grazie ad una serie di omologie tra il 28S e il 5.8S che formano legami idrogeno; quindi  abbiamo un taglio e la formazione dei due RNA 28S e 5.8S che comunque rimangono uniti.
Nell'uomo, i geni che codificano per gli rRNA 18S, 5.8S e 28S sono trascritti nel nucleolo dalla RNA polimerasi di tipo I. Questi geni sono organizzati sono organizzati in un’ unica unità di trascrizione policistronica di 13kb, in quanto vengono trascritti più o meno contemporaneamente, e uno spaziatore non-trascritto di 27kb; questa sequenza di 40kb è costituita dall’unità di trascrizione e dallo spaziatore (13kb+27kb) ed  è ripetuta in tandem dalle 30 alle 40 volte su ciascun braccio corto dei cinque cromosomi acrocentrici. In pratica, su ciascuno dei 5 cromosomi il cluster di ripetizioni è più o mendo di 1,5Mb (ricordiamoci che senza questi geni non esisterebbero i ribosomi e quindi la traduzione). Il 5S è, invece, trascritto dalla RNA polimerasi di tipo III, presenta sequenze ripetute in tandem e il cluster maggiore si trova sul cromosoma numero 1, che è il più grande nella specie umana, sul braccio lungo nella posizione terminale (1q42). Ci sono almeno 200-300 geni veri e propri e  sono presenti moltissimi psudogeni dispersi nel genoma che, in effetti, sono degli RNA 5S retrotrascritti in DNA e inseriti nel genoma.
Comunque, per quanto riguarda i ribosomi  negli eucarioti superiori, dobbiamo dire che l'unità ribosomica grande contiene il 28S, 5.8S e il 5S, mentre, l'unità ribosomica piccola solo 18S. Nelle cellule interfasiche in attiva sintesi le regioni NORs (rDNA 18S, 5,8S e 28S) sono riunite in agglomerati più scuri, i cosiddetti nucleoli, organelli privi di membrana che, però, contengono tutto il materiale necessario alla sintesi dei ribosomi; tra i diversi organismi si osservano differenze nel numero di nucleoli, che può variare da uno a molti per assetto aploide. Si è visto, nelle specie che posseggono più di una coppia di cromosomi come organizzatore nucleolare, che il numero di nucleoli non corrisponde al numero dei cromosomi in quanto molti tendono a fondersi insieme per formare un unico organello e successivamente scompaiono all'inizio della mitosi per poi riassemblarsi nelle cellule figlie appena entrano in interfase. In generale, i nucleoli sono costituiti da diverse componenti:
nella parte più centrale troviamo un centro fibrillare (FC) assente negli eucarioti inferiori che corrisponde al sito di trascrizione dell’ rRNA;
all'esterno del centro fibrillare c'è la componente fibrillare densa (DFC) che contiene i pre rRNA di nuova sintesi, cioè i trascritti di RNA che devono essere processati;
all'esterno della componente fibrillare densa abbiamo una componente granulare (GC) costituita da particelle pre-ribosomiali quasi mature e destinate, per questo,  al citoplasma per formare i ribosomi;
il nucleolonema è la sub-struttura del nucleolo presente nella componente fibrillare densa e nel centro fibrillare (DFC+FC).
In tutto il processo di trascrizione, traduzione e maturazioni intervengono diverse proteine nucleolari che hanno molteplici localizzazioni e diversi pesi molecolari. Ad esempio l'RNA polimerasi I si riscontra dove avviene la trascrizione e la maturazione, quindi nel centro fibrillare e nei centri fibrillari densi . Comunque, il processo che porta alla maturazione dei ribosomi veniva molto studiato, quando ancora non esistevano tecniche di biologia molecolare avanzata, per capire l'attività dei geni e, in modo particolare quando questi venivano attivati o silenziati. Si scoprì, infatti, che esiste un complesso che viene chiamato NoRC che agisce nel rimodellamento nucleolare. Questo complesso viene reclutato da TTF-1 (fattore di terminazione della trascrizione) sul promotore rDNA. L'insieme di questi recluta una deacetilasi istonica (HDCA1) che media la deacetilazione delle code degli H4 e quindi  rimodella la cromatina dell’rDNA. Dopo di che, per il silenziamento, le regioni CpG vengono esposte e metilate inducendo il legame con altri fattori che provocano un silenziamento (meccanismo molto complesso) con la formazione dell'eterocromatina, ossia di DNA compatto non trascrivibile. Negli ultimi anni, si è visto che se si considera la fase S, si può vedere che le regioni attive che trascrivono l'RNA ribosomiale vengono replicate presto nella fase S mentre avendo la struttura della cromatina più aperta invece, le regioni silenti, che appunto sono state silenziate con il complesso di rimodellamento nucleolare, vengono replicate più tardivamente, sempre nella fase S.  Quindi abbiamo una replicazione bifasica in quanto  ripetizioni di rDNA attive replicano precocemente, quelle silenti replicano tardivamente in quanto la struttura della cromatina è compatta e quindi non hanno facile accesso tutti i componenti della trascrizione.
Le tecniche che vengono utilizzate per evidenziare le regioni organizzatrici del nucleolo sono:
N-banding (bandeggio): in cui gli organizzatori nucleolari vengono colorati intensamente ma la tecnica rovina i cromosomi e però non funziona in Drosophila;
Ag NOR Banding: che evidenzia solo i NORs trascrizionalmente attivi.