Le colture cellulari
Una coltura cellulare è costituita da un gruppo omogeneo di cellule eucariotiche provenienti da tessuti animali; le colture sono mantenute in vita per tempi anche molto lunghi, usando condizioni sperimentali appropriate. Ottenere colture cellulari partendo dai tessuti degli organismi superiori è un’operazione complessa, dato che tali tessuti sono eterogenei (cioè presentano tipi cellulari diversi tra loro).
- Separando le cellule in base alle loro dimensioni o al loro peso, centrifugandole a bassa velocità con l’ausilio di sostanze (es Percoll, Ficoll o Lymphoprep) che possono anche essere stratificate in gradienti a diversa densità;
- Sfruttando la diversa attitudine dei diversi tipi cellulari ad aderire su superfici di vetro o di plastica;
- Marcando le cellule con anticorpi coniugati con sostanze fluorescenti, e poi separando le cellule marcate da quelle non marcate;
- Utilizzando terreni di coltura selettivi che favoriscano la crescita solo di alcuni tipi cellulari e/o aggiungendo al terreno di coltura ormoni che favoriscono (o inibiscono) la crescita di determinati tipi cellulari.
MEM (Minimum Essential Medium): è il terreno di coltura;
FBS (Siero Fetale Bovino): contiene numerosi fattori di crescita (non contenuti nel terreno di coltura) utili per la crescita delle cellule.
TRIPSINA: enzima proteolitico che rompe i legami peptidici delle proteine extracellulari che costituiscono il substrato su cui le cellule sono ancorate (nel nostro caso serve per staccare le cellule dalla plastica della fiasca): la temperatura ottimale per il suo funzionamento è 37°C ma funziona anche a temperatura ambiente. In questo caso occorre lasciar agire per un tempo più lungo.
FIASCHE: sono i “contenitori” in cui le cellule proliferano. Internamente sono sterili; possono avere un tappo ventilato, cioè con un filtro che permette gli scambi gassosi e contemporaneamente garantisce la sterilità della coltura.
TUBI: sono provette a fondo conico con capienza di 15 e 50 ml utilizzate per riporre i reagenti liquidi e per la centrifugazione delle sospensioni cellulari.
Il terreno di coltura, invece, viene scelto in base alle caratteristiche e alle esigenze del tipo cellulare utilizzato. Può essere liquido (pronto all’uso) oppure in polvere (in tal caso deve essere ricostituito come indicato dalla casa produttrice). In ogni caso il terreno di coltura deve avere le seguenti caratteristiche: 1) deve avere determinati valori di pH e osmolarità; 2) deve essere non tossico; 3) deve contenere tutti i composti necessari al metabolismo cellulare, e precisamente: ioni, per mantenere il bilancio osmotico; zuccheri, come fonte di energia; amminoacidi, per la formazione di proteine; vitamine, cofattori enzimatici.
1)Tutte le manipolazioni delle colture cellulari vengono fatte in cappe a flusso laminare provviste di filtri, che limitano la contaminazione occasionale con microrganismi trasportati dall'aria.
2)Tutti i materiali utilizzati per la manipolazione (pipette, piastre da coltura) sono sterili e di norma monouso.
3)Ai terreni di coltura vengono spesso aggiunti antibiotici per limitare la possibilità di inquinamento da parte dei più comuni batteri.
I sistemi di sterilizzazione che servono appunto per ovviare a questi problemi sono tutt'oggi:
Filtri : si utilizzano per sterilizzare i terreni, i tamponi o altre sostanza allo stato liquido. Si tratta di membrane di cellulosa o altre sostanze (nylon, nitrocellulosa, polisulfone, policarbonato; la scelta del tipo di filtro dipende dalla sostanza che dobbiamo filtrare) che differiscono per la porosità (di solito usiamo membrane con pori da 0,2 m che ci permettono di filtrare i possibili contaminanti presenti nella soluzione) e per il diametro (dipende dall’uso che ne vogliamo fare, ad esempio se vogliamo applicarlo ad una siringa o ad un apparato di filtrazione). Durante l’uso è consigliabile non applicare una pressione troppo alta che provocherebbe una rottura del filtro.
Mezzi chimici: si usano sostanze dal conosciuto potere germicida, diluite alle concentrazioni opportune. Le sostanze più usate sono l’ipoclorito di sodio (concentrazione [c] d’uso 2%), lo Zefirol ([c] d’uso dall’1% al 5%) e l’etanolo ([c] d’uso 70%). Si utilizzano per la pulizia degli strumenti, della cappa, dell’incubatore, delle mani dell’operatore e di tutto ciò che non può essere sterilizzato con altri mezzi.
Mezzi fisici : sono due, i raggi ultravioletti ed il calore. L’uso dei raggi ultravioletti è possibile grazie all’esistenza di particolari lampade (lampade UV) che vengono accese nella cappa sterile e/o nell’ambiente in cui è posta la cappa. Tali lampade vanno tenute accese minimo due ore, preferibilmente tutta la notte.
I vantaggi derivati dall'uso delle colture cellulari sono:
Le colture costituiscono un materiale abbondante ed omogeneo per lo studio delle cellule sia in condizioni fisiologiche che in seguito al trattamento con agenti chimici, fisici e biologici.
Si possono ottenere cloni e varianti della cellula originale.
Si possono congelare e recuperare a distanza di anni.
Si possono testare contemporaneamente anche un gran numero di condizioni sperimentali con risparmio di tempo (il tempo necessario per osservare una modificazione in vivo è molto più lungo di quello necessario per vedere una modificazione in vitro ).
L’uso delle colture permette di evitare la vivisezione ed il sacrificio di animali.
La coltura cellulare è un sistema più economico rispetto al mantenimento di animali.
L’uso delle colture permette di ottenere dati riproducibili.
Gli svantaggi invece risultano essere:
L’uso delle colture fornisce una visione un po’ “ristretta” della realtà, in quanto non è possibile tener conto di tutte le variabili che intervengono in vivo , e nemmeno riprodurle in vitro.
Su alcune linee cellulari non possono essere effettuati alcuni tipi di studi (ad esempio studi sull’inibizione da contatto non possono essere effettuati sulle cellule tumorali).
Pericolo di contaminazioni.
Esperienza degli operatori.
Il protocollo standard per la crescita di una coltura cellulare può essere schematizzato: Da una fiasca contenente cellule a confluenza: Scartare il terreno di coltura; Lavare con MEM senza siero; Aggiungere tripsina; Lasciar agire la tripsina per circa 5 min a 37°C; In questo tempo preparare un tubo contenente MEM + FCS al 10%; Trascorsi i 5 minuti, verificare che le cellule si siano staccate; quindi aggiungere il MEM + FCS al 10% e centrifugare (10 min a 500xg); Scartare il sopranatante (sul fondo del tubo è visibile il pellet, composto dalle cellule sedimentate); Aggiungere al sedimento una piccola quantità (circa 1 ml) di MEM + FCS al 10% per effettuare una risospensione graduale delle cellule; aggiungere altro MEM + FCS al 10% fino a raggiungere il volume desiderato. Prelevare un certo volume di sospensione cellulare e seminare in fiasca; il volume di sospensione cellulare da seminare dipende dalla superficie di crescita della fiasca e dalla densità desiderata (nel nostro caso seminiamo 2 ml di sospensione cellulare in una fiasca che ha superficie di crescita di 25cm2, contenente 10 ml di MEM + FCS al 10%). (Come sappiamo la capacità delle cellule di crescersi e dividersi è controllata da un orologio cellulare. Quest'ultimo è composto da proteine che integrano i segnali pro- e anti- proliferanti provenienti dall'ambiente esterno e dall'interno della cellula. Abbiano dei regolatori positivi che attivano il ciclo cellulare e invece dei regolatori negativi che lo inibiscono.
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Dettagli appunto:
- Autore: Domenico Azarnia Tehran
- Università: Università degli Studi di Roma La Sapienza
- Facoltà: Scienze Matematiche, Fisiche e Naturali
- Corso: Scienze Biologiche
- Esame: Virologia
- Titolo del libro: Elementi di virologia molecolare
- Autore del libro: Alan J. Cann
- Editore: Ambrosiana
- Anno pubblicazione: 2006
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