Organizzazione della struttura completa della proteina
ORDINAMENTO DEI FRAMMENTI PEPTIDICI
Stabilita
la sequenza dei frammenti peptidici, ci resta da stabilire l'ordine con
cui essi sono legati nel polipeptide originale. Possiamo ottenere
questo ordine confrontando le sequenze amminoacidiche di un gruppo di
frammenti peptidici con quelle di un altro gruppo di frammenti
peptidici, prodotti con un sistema di rottura diverso dal primo, i cui
punti di rottura si possano sovrapporre a quelli della prima serie. Le
regioni di sovrapposizione devono essere sufficientemente lunghe da non
consentire statisticamente errori in queste disposizioni.
POSIZIONE DEI PONTI DISOLFURO
La
tappa finale dell'analisi della sequenza amminoacidica è quella che
consente la determinazione della posizione dei ponti disolfuro (se ve ne
sono). É possibile ottenere ciò rompendo un campione di proteina
nativa, con i suoi ponti disolfuro intatti, in modo da ottenere coppie
di frammenti peptidici contenenti ognuno un singolo residuo di Cys
impegnato in un legame disolfuro. Questi peptidi possono essere
identificati mediante elettroforesi diagonale. Con questa tecnica il
digerito viene sottoposto ad un elettroforesi bidimensionale con due
procedimenti uguali. Dopo la prima corsa, l'elettroforetogramma viene
esposto a vapori di acido performico che ossidano i residui di cistina
ad acido cisteico. Dopo la seconda corsa elettroforetica quei frammenti
peptidici che sono disposti sulla diagonale dell'elettroforetogramma, e
quindi non sono stati modificati dal trattamento con acido performico,
non contengono legami disolfuro. Quei frammenti che originalmente
contenevano un ponte disolfuro ed erano formati da due peptidi vengono
rotti dal trattamento con acido performico e quindi migrano in modo
diverso nella seconda corsa elettroforetica, spostandosi dalla
diagonale. Dopo aver isolato il frammento polipeptidico contenente il
ponte disolfuro, quest'ultimo viene rotto e viene determinata la
sequenza dei due peptidi. La posizione dei ponti disolfuro viene
stabilita confrontando la sequenza amminoacidica di questi frammenti
polipeptidici con quella della proteina.
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Dettagli appunto:
- Autore: Domenico Azarnia Tehran
- Università: Università degli Studi di Roma La Sapienza
- Facoltà: Scienze Matematiche, Fisiche e Naturali
- Corso: Scienze Biologiche
- Esame: Chimica biologica
- Titolo del libro: Biochimica
- Autore del libro: Donald Voet e Judith G. Voet
- Editore: Zanichelli
- Anno pubblicazione: 1993
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