Preparazione della proteina per la determinazione della sequenza

a. ANALISI DEI GRUPPI TERMINALI: QUANTE SUBUNITÀ DIVERSE
Ogni catena polipeptidica possiede un residuo N-terminale ed uno C-terminale. Identificando questi residui terminali, possiamo stabilire il numero di polipeptidi chimicamente distinti presenti in una proteina. Nel metodo di identificazione del residuo N-terminale più usato, la degradazione di Edman, il fenilisotiocianato (PITC, reagente di Edman) reagisce con i gruppi amminici N-terminali delle proteine in condizioni moderatamente alcaline formando il loro addotto feniltiocarbammilico (PTC). Questo prodotto viene trattato con acido fluoridrico anidro che stacca il residuo N-terminale sotto forma di derivato tiazolinonico, ma non idrolizza altri legami peptidici. La degradazione di Edman, quindi, rilascia il residuo amminoacidico N-terminale, ma lascia intatta la restante parte della catena polipeptidica. I derivato amminoacil-tiazolinone viene quindi estratto selettivamente in un solvente organico e convertito in feniltioidantoina (PTH), che è chimicamente più stabile. Questo PTH-amminoacido può essere identificato tramite vari tipi di cromatografia. A questo punto sottoponendo la catena polipeptidica a cicli ripetuti della degradazione di Edman, possiamo determinare la sequenza amminoacidica, identificando ogni volta il PTH-amminoacido liberato. Tutt'oggi questa tecnica è stata automatizzata, portando ad un grande risparmio di tempo e di materiale. Per quanto riguarda il residuo C-terminale, è possibile ottenere un risultato che si avvicina alla degradazione di Edman, utilizzando enzimi come le esopeptidasi (enzimi che staccano il residuo terminale da un polipeptide). Una classe di esopeptidasi, le carbossipeptidasi, catalizzano l'idrolisi del residuo C-terminale dei polipeptidi, mentre, le amminopeptidasi, staccano sequenzialmente amminoacidi dall'estremità N-terminale di un polipeptide. Comunque bisogna ricordare che questi enzimi non riescono ad indicare la sequenza amminoacidica in quanto i tempi di idrolisi e quindi di verifica delle diverse subunità non è facile da osservare e rilevare.
b. ROTTURA DEI PONTI DISOLFURO
La tappa successiva nell'analisi della sequenza è la rottura dei ponti disolfuro tra residui di Cys. Questi possono essere rotti ossidativamente dall'acido performico oppure riduttivamente da mercaptani (composti contenenti SH). L'ossidazione con acido performico converte tutti i residui di Cys, che siano o meno impegnati in un legame S—S, in residui di acido cisteico, in modo tale che si rompano i ponti disolfuro e che il contenuto totale di Cys possa essere misurato tramite la misurazione dell'acido cisteico che si è formato. I principali svantaggi, però, del trattamento con acido preformico sono l'ossidazione contemporanea dei residui di Met a residui di metionina sulfone e la distruzione in parte delle catene laterali dei residui di Trp. Soprattutto per questi ultimi motivi, la rottura riduttiva dei ponti disolfuro ad opera dei mercaptani, come il 2-mercaptoetanolo, è molto più compatibile con le strategie utilizzate nella determinazione della struttura primaria.
Separazione e purificazione delle catene polipeptidiche
I polipeptidi non identici che eventualmente costituiscono una proteina devono a questo punto essere separati e purificati in vista della loro sequenziazione. La dissociazione delle subunità, come pure la denaturazione, avviene in condizioni acide o basiche, ad una concentrazione salina bassa, ad elevata temperatura oppure mediante l'uso di agenti denaturanti. A questo punto, le subunità dissociate possono essere separate mediante metodi come la cromatografia a scambio ionico o per gel filtrazioni, o comunque tutti metodi che riconoscono piccole differenze nella dimensione e nella polarità del polipeptide.
c. COMPOSIZIONE IN AMMINOACIDI
Prima di iniziare il lavoro di sequenziamento è importante conoscere la composizione in amminoacidi, cioè il numero di ogni tipo di amminoacido presente nella molecola. La composizione in amminoacidi di una subunità viene determinata mediante la sua idrolisi completa seguita da un analisi quantitativa degli amminoacidi liberati. É possibile ottenere l'idrolisi di un polipeptidi sia chimicamente (acidi e basi) e sia enzimaticamente, ma nessuno di questi metodi è completamente soddisfacente. Oggi il contenuto di amminoacidi viene determinato quantitativamente usando un analizzatore automatico di amminoacidi. Questo strumento separa gli amminoacidi con una cromatografia a scambio ionico e con una cromatografia in fase inversa utilizzando l'HPLC. Comunque, bisogna ricordare, che prima a dopo la colonna gli amminoacidi vengono trattati con alcune sostanze come il 2-mercaptoetanolo, che forma con gli amminoacidi un addotto altamente fluorescente che può essere rilevato. Infatti gli amminoacidi vengono identificati sulla base del loro volume di eluzione caratteristico o dall'intensità della fluorescenza. Con i moderni analizzatori di amminoacidi, è possibile avere l'analisi completa di un digerito proteico in meno di un'ora usando quantità di materiale molto limitate.
d. REAZIONI SPECIFICHE PER LA ROTTURA DEL LEGAME PEPTIDICO
I residui più lunghi di 40-80 residui amminoacidici non possono essere sequenziati direttamente per questo devono essere rotti chimicamente o enzimaticamente. Ad esempio l'enzima digestivo tripsina rompe i legami peptidici sul lato C-terminale dei residui carichi positivamente Arg e Lys, se il residuo successivo non è Pro. Poiché la tripsina rompe i legami peptidici che seguono residui carichi positivamente è possibile aggiungere o togliere in una catena polipeptidica siti di rottura per la tripsina, aggiungendo o togliendo chimicamente cariche positive dalla catena. Per esempio, la carica positiva su un residuo di Lys può essere eliminata dal trattamento con un'anidride dicarbossilica, come l'anidride citraconica. Anche alcuni reagenti chimici possono rompere il legame peptidico a livello di specifici residui. Il più usato di questi reagenti, il bromuro di cianogeno (NCBr), determina la rottura specifica e quantitativa sul lato C di residui di Met formando un peptidil omoserina lattone.