Isolamento delle proteine: metodi di solubilizzazione

La prima tappa del procedimento di isolamento di una proteina o di qualsiasi altra molecola biologica è quella di portarla in soluzione. In alcuni casi, come per le proteine del siero sanguigno, la natura ha già svolto per noi questo lavoro. La maggior parte delle proteine deve però essere liberata dalle cellule che la contiene. Se la proteina che ci interessa è localizzata nel citoplasma della cellula, la sua liberazione richiede soltanto l'apertura (lisi) della cellula. Il metodo più semplice e meno traumatico per ottenere ciò è quello noto come lisi osmotica, in cui la cellula viene posta in una soluzione ipotonica, cioè in una soluzione in cui la concentrazione totale dei soluti è più bassa di quella presente nella cellula in condizioni fisiologiche. Sotto l'influenza della forza osmotica, l'acqua diffonde nella soluzione intracellulare più concentrata, causando il rigonfiamento e l'esplosione della cellula stessa. Questo metodo è particolarmente idoneo per le cellule di origine animale, ma è inefficace con le cellule che possiedono parete cellulare come i batteri e le cellule vegetali. In questi casi è più efficace l'uso di un enzima come il lisozima che degrada chimicamente la parete cellulare dei batteri. Per altri tipi cellulari, invece, vi è bisogno di una sorta di distruzione meccanica. Questi trattamenti comprendono la macinazione in presenza di sabbia o di allumina, di una pressa oppure di della sonicazione, con cui le cellule vengono rotte dalle vibrazioni ultrasoniche. Una volta che le cellule sono state rotte, il lisato grezzo può essere filtrato o centrifugato per allontanare le parti di cellule ancora intatte, lasciando quindi la proteina che ci interessa nel sopranatante. Se questa proteina è una componente di struttura subcellulare come la membrana o i mitocondri, è possibile ottenere un notevole grado di purificazione della proteina in esame separando per prima cosa la struttura subcellulare da tutto il materiale cellulare. Ciò può essere effettuato mediante la centrifugazione differenziale, un processo un cui il lisato cellulare viene centrifugato ad una velocità che determina la sedimentazione soltanto dei componenti cellulari più densi, seguita da una seconda centrifugazione che sedimenta gli organelli meno densi. A questo punto nel caso la proteina sia saldamente legata alla membrana viene solubilizzata, dal componente cellulare purificato mediante detergenti o con solventi organici, come il butanolo e il glicerolo, che solubilizzano i lipidi.