Isolamento delle proteine: dosaggio

Isolamento delle proteine: dosaggio

Per poter purificare una qualsiasi sostanza, è necessario trovare un metodo che ci possa rilevare quantitativamente la sua presenza. Un metodo di dosaggio, però, deve essere specifico per la proteina da purificare e molto sensibile per rilevarne la presenza anche in tracce. Inoltre, il dosaggio deve essere semplice e facilmente attuabile, in quanto deve essere ripetuto numerose volte durante le varie tappe del processo di purificazione. Tra i dosaggi di proteine più diretti vi sono quelli degli enzimi che catalizzano reazioni i cui prodotti possono essere facilmente valutati. Appartengono a questa categoria prodotti che per esempio abbiano assorbimenti spettroscopici caratteristici oppure un'emissione di fluorescenza che possa essere misurata. Le proteine che non sono enzimi, invece, possono essere dosate mediante la valutazione dei loro effetti biologici. Per esempio, la presenza di un ormone può essere rilevata dai suoi effetti su alcuni campioni di un tessuto standard oppure su un intero organismo. Questo tipo di dosaggio è di norma un procedimento molto lungo, in quanto per ottenere le risposte biologiche sono necessari anche giorni. Tutt'oggi le tecniche di dosaggio più utilizzate sono le tecniche immunochimiche che ci consentono di dosare le proteine con un elevato grado di sensibilità e di discriminazione. Questi metodi utilizzano anticorpi, proteine prodotte dal sistema immunitario di un animale in risposta all'introduzione di una proteina estranea che si legano specificamente alla proteina estranea. Gli anticorpi, estratti dal siero sanguigno di un animale che è stato immunizzato contro una particolare proteina, vengono prodotti da particolari cellule che muoiono dopo poche divisioni cellulari e non possono essere coltivate. Per questo, anticorpi monoclonali possono essere ottenuti fondendo la cellula che produce l'anticorpo desiderato con una cellula di cancro del sistema immunitario, noto come mieloma. La risultante cellula di ibridoma ha una capacità illimitata di dividersi e, quando viene coltivata, produce grandi quantità dell'anticorpo monoclonale. Una proteina, a questo punto, può essere determinata mediante una tecnica chiamata dosaggio radioimmunologico  o più specificatamente ELISA:
l'anticorpo contro la proteine che si deve dosare viene immobilizzato su un supporto inerte;
la soluzione della proteina che deve essere dosata viene messa in contatto con la superficie rivestita dall'anticorpo immobilizzato in condizioni che favoriscano il loro legame;
il complesso proteina-anticorpo che si è formato viene fatto reagire con un secondo anticorpo specifico per la proteina e che può essere determinato mediante l'enzima a cui è legato covalentemente;
dopo aver lavato ed allontanato tutto l'anticorpo con l'enzima legato che non ha reagito, viene dosata l'attività dell'enzima presente nel complesso immobilizzato anticorpo-proteina-anticorpo-enzima; questa determinazione ci dirà anche la quantità di proteina presente;
STRATEGIA GENERALE PER LA PURIFICAZIONE DELLE PROTEINE
Una volta effettuati tutti questi passaggi, le proteine vengono purificate da procedimenti di frazionamento. In una serie di tappe indipendenti, vengono sfruttate le varie proprietà chimico-fisiche della proteina che ci interessa per separarla progressivamente da altre sostanze. Il punto importante è, dunque, quello di eliminare selettivamente tutti gli altri componenti della miscela originale in modo da ottenere una soluzione che contenga solo la proteina richiesta. Le caratteristiche chimico-fisiche della proteina che vengono utilizzate nei vari procedimenti di purificazione sono la solubilità, la carica ionica, la massa molecolare, le proprietà di assorbimento e l'affinità di legame.