Allestimento di colture cellulari e impiego delle colture primarie nelle biotecnologie

Allestimento di colture cellulari e impiego delle colture primarie nelle biotecnologie

Per preparare una coltura a partire da un organo o da un tessuto e necessario ricorrere all'uso di mezzi meccanici o enzimatici per ottenere una sospensione omogenea di cellule. Quasi sempre viene preferita la digestione enzimatica che seleziona le cellule che sono in grado si resistere al trattamento con l'enzima conservando la capacità di aderire al substrato e di proliferare. Il successo di una cultura primaria è maggiore impiegando tessuti embrionali, nei quali è alto il numero di cellule indifferenziate e proliferanti e per i quali la minor quantità di tessuti fibrosi non rende necessario un lungo trattamento con l'enzima che potrebbe danneggiare le cellule isolate. La tripsina è l'enzima più frequentemente impiegato per la disgregazione perché è ben tollerata da molti tessuti e viene facilmente neutralizzata con il siero. La disgregazione con tripsina può essere fatta a caldo o a freddo. Il primo protocollo prevede un'incubazione in agitazione del tessuto sminuzzato finemente e posto in tripsina a 37°C. Ogni mezz'ora circa le cellule separate vengono prelevate e, una volta rimossa la tripsina, vengono sospese in un nuovo mezzo che può contenere il siero. Questa tecnica viene utilizzata quando di ha a disposizione una buona quantità di tessuto di partenza ed è invece sconsigliabile per i tessuti ricchi di connettivo. La disgregazione con tripsina a freddo, invece, è consigliabile quando si ha a disposizione poco tessuto. I tessuti, infatti, vengono immersi in tripsina a 4°C per 3 o 4 ore in modo che l'enzima possa penetrarli senza danno. La temperatura viene poi portata a 37°C per pochi minuti, per far avvenire una rapida disgregazione. Le tecniche di isolamento delle cellule a partire da un tessuto prevedono anche l'impiego come agente dissociate di acido etilendiaminotetracetico (EDTA). Una volta ottenuta la sospensione cellulare, contare le cellule, valutarne la vitalità e procedere all'utilizzazione della preparazione delle cellule come tali, cioè in sospensione, oppure procedere alla semina su piastre o fiasche. Ad esempio, la tecnica di perfusione in situ del fegato di ratto, prevede, dopo anestesia dell'animale, l'incisione della parete addominale al fine di isolare la vena porta. La perfusione del fegato viene effettuata, attraverso la vena porta, con il passaggio di una soluzione fisiologica priva di calcio e magnesio, addizionata con Na2EDTA, che, come chelante, ha il compito di intrappolare gli ioni calcio, riducendo così l'adesione cellulare. Durante la perfusione viene effettuata un'incisione sulla vena cava addominale per consentire il deflusso del sangue e della soluzione fino a quando il fegato risulta uniformamente sbiancato; a questo punto la perfusione viene continuata addizionando calcio e collagenasi, che, digerendo la matrice cellulare, consentono la separazione delle cellule. A questo punto, il fegato viene rimosso dalla cavità addominale e, grazie a un particolare “pettine” in acciaio con punte arrotondate, vengono recuperate le cellule: il risultato finale è una sospensione di epatociti vitali. Per l'uomo abbiamo una situazione simile al ratto. A questo punto, la sospensione di epatociti, sia di ratto sia umani, che si ottiene al termine della perfusione, viene filtrata su un retino di nylon al fine di allontanare residui di tessuto non completamente digeriti. Le cellule vengono raccolte per centrifugazione a 4°C per 4 minuti al fine di eliminare le cellule danneggiate che, avendo minore densità, non sedimentano e possono quindi essere allontanate con il sovranatante. Dopo aver verificato la vitalità e la concentrazione cellulare, la sospensione viene seminata su piastre di Petri in plastica. L'adesione cellulare si completa di solito in 90 minuti di incubazione a 37°C in presenza di CO2 al 5%; per gli epatociti umani l'adesione risulta migliore dopo 3 ore di incubazione. Al termine di questa fase le piastre vengono lavate con soluzione fisiologica per asportare le cellule morte non adese. Una volta ottenuta la coltura cellulare per poter sopravvivere nel tempo, necessita di alcune “cure”: bisogna provvedere al ricambio del terreno di coltura quando esso sia divenuto inutilizzabile per le cellule e bisogna provvedere ad effettuare una “espansione” o “subcoltura” quando le cellule siano giunte ad occupare tutto lo spazio disponibile all'interno del recipiente di coltura, per cui si dice che sono giunte a confluenza (contatto”). Comunque, le colture primarie trovano molte applicazioni in ambito farmacologico, tossicologico e naturalmente biologico. Ad esempio la valutazione della tossicità di nuovi farmaci su cellule umane e di roditore può essere utile nella fase di studio e sviluppo di nuove molecole. Per questo si utilizzano test che valutano la sopravvivenza-mortalità e la crescita cellulare. Il protocollo prevede che la sostanza in esame venga disciolta nel terreno di coltura, osservando dopo un periodo di tempo prefissato la percentuale di cellule sopravvissute al trattamento rispetto ai controlli (colture non trattate). Le cellule possono venire discriminate con coloranti, come ad esempio il Trypan blue, che permette di distinguere le cellule vitali da quelle morte, in quest'ultime infatti l'alterata permeabilità cellulare di membrana permette la penetrazione del colorante all'interno della cellula stessa, e quindi appaiono blu. Se, invece, vogliamo studiare l'integrità strutturale delle nostre cellule sottoposte a qualche molecola di interesse farmacologico o tossicologico abbiamo diversi test: test del Rosso Neutro, basato sull'accumulo del colorante Rosso neutro nei lisosomi delle cellule vive, che hanno quindi normalmente funzionalità delle membrane, mentre le cellule morte non presentano tale accumulo (la valutazione analitica si effettua tramite spettrofotometro); il saggio con dietilfluorescina, il colorante viene trattenuto dalle cellule integre e viene idrolizzato nel fluorocomo corrispondente, la fluorescina, la quale viene trattenuta all'interno delle cellule nel citoplasma; il saggio con bromuro di etidio, il colorante penetra soltanto nelle cellule che hanno la membrana alterata, colorando gli acidi nucleici delle cellule danneggiate. Per verificare invece l'integrità metabolica si usano: strumenti per vedere il rilascio di enzimi, che valutano quindi il rilascio di lattico deidrogenasi (LDH), fosfatasi acida ecc. da parte delle cellule; test MMT (tetrazolium salt), si basa sulla trasformazione dei sali del tetrazolio (MMT) in formazano da parte delle cellule vitali per mezzo di enzimi cellulare (deidrogenasi mitocondriali); Oltre ai test farmacologici le colture cellulari sono state indispensabili per l'osservazione di infezioni virali, per la genetica umana e quindi per evidenziare la posizione e la funzione dei geni sui cromosomi nonché il ciclo cellulare, per lo studio dei tumori attraverso cellule trasformate in coltura, per la caratterizzazione di canali ionici ed infine per la produzione di proteine e di anticorpi di interesse biomedico.