La forca replicativa

Nella cellula, entrambi i filamenti della doppia elica vengono replicati contemporaneamente. Perché avvenga ciò è necessaria la separazione dei due filamenti della doppia elica in modo tale da creare due catene di DNA stampo a singolo filamento, grazie a enzimi denominati DNA elicasi. Questi enzimi si legano e si spostano lungo il singolo filamento di DNA utilizzando l'energia fornita dall'idrolisi di nucleotidi trifosfato: di solito ATP. Di solito le DNA elicasi che agiscono a questo livello sono proteine esameriche che assumono una conformazione ad anello circondando uno dei due filamenti. Ciascuna elicasi si sposta lungo il DNA in una direzione definita e possono avere una polarità sia 5'→3' che 3'→5'. Dopo il passaggio della DNA elicasi, il singolo filamento generato non può riappaiarsi con il filamento complementare in quanto deve essere usato come stampo per la sintesi della nuova catena di DNA. Per stabilizzare le catene separate esistono delle proteine: le SSB (single stranded binding protein), che rapidamente si legano ad un singolo filamento. La presenza di una SSB facilita il legame di un'altra SSB sul tratto di DNA adiacente, agendo in maniera cooperativa.  Questo legame cooperativo assicura che il singolo filamento, una volta creato dal passaggio dell'elicasi, venga rapidamente ricoperto dalle SSB. Bisogna, inoltre, specificare che nel momento in cui i due filamenti vengono separati, a valle della forca replicativa si formano dei superavvolgimenti positivi. Questo accumulo di superavvolgimenti è il risultato dell'attività della DNA elicasi che elimina i legami idrogeno fra le catene complementari. Queste supereliche vengono rimosse dalle DNA topoisomerasi che agiscono sul DNA a valle del sito di replicazione. Questi enzimi riescono a compiere questa attività tagliando o uno o entrambi i filamenti del DNA senza distaccarsi dal substrato e passando l'altro filamento attraverso la rottura e successivamente richiudendo il filamento interrotto. Comunque, man mano che avviene la sintesi, il punto che si trova tra i due filamenti separati e la doppia elica che ancora non ha subito il processo di divisione è conosciuto come forca replicativa ed è il punto dove vengono sintetizzate le nuove catene di DNA. Però, la natura antiparallela della doppia elica crea una complicanza per la replicazione simultanea dei due stampi alla forca replicativa. Poiché il DNA è sintetizzato aggiungendo nucleotidi al terminale 3', soltanto uno dei filamenti stampo può essere replicato seguendo in modo continuo la progressione della forca replicativa. Su questo filamento stampo, la polimerasi semplicemente segue la forca replicativa e il DNA neosintetizzato è conosciuto con il nome di leading strand (filamento continuo). La sintesi del DNA, che ha come stampo l'altro filamento, è più problematica. Questo stampo impone alla DNA polimerasi di muoversi in direzione opposta rispetto alla direzione di espansione della forca replicativa. Il DNA neosintetizzato su questo stampo è conosciuto come lagging strand (filamento ritardato). In quest'ultimo filamento, ogni qual volta si crea dello stampo di lunghezza adeguata, inizia la sintesi di DNA fino a raggiungere il terminale 5' del precedente tratto di DNA già sintetizzato. I risultanti frammenti di nuova sintesi vengono chiamati frammenti di Okazaki e possono variare in lunghezza dai 1000 ai 2000 nucleotidi nei batteri e dai 100 ai 400 nucleotidi negli eucarioti. Subito dopo essere stati sintetizzati questi frammenti vengono uniti covalentemente l'uno all'altro per creare un filamento continuo di DNA. Comunque, in entrambi i filamenti, tutte le DNA polimerasi richiedono un innesco che presenti un OH sul 3' dello zucchero, infatti questi enzimi non possono iniziare la sintesi di DNA de novo. Per questo la cellula utilizza la primasi, un RNA polimerasi specializzata che permette la formazione di corti (5-10 nucleotidi) RNA primer (innesco) che vengono sintetizzati utilizzando come stampo DNA a singolo filamento. Questi RNA primer sono successivamente allungati dalla DNA polimerasi e utilizzati per la sintesi in quanto le DNA polimerasi sono in grado di iniziale la sintesi usando sia inneschi di RNA che di DNA. Bisogna, però, ricordare che mentre il filamento continuo richiede un unico RNA primer, la sintesi discontinua sul filamento discontinuo è possibile a patto che venga sintetizzato un RNA primer ogni frammento di Okazaki. In generale, oltre che con la primasi, l'innesco può essere fornito da un nick, ossia un taglio su un filamento del DNA che rilascia un'estremità 3'-OH, oppure da alcune proteine che possono fornire la stessa estremità libera.
Affinché la replicazione del DNA sia completa, gli RNA primer utilizzati per la sintesi devono essere eliminati e rimpiazzati con deossiribonucleotidi. Per questo motivo interviene un enzima chiamato RNAsi H che riconosce e rimuove la maggior parte di ciascun primer. Questo enzima idrolizza specificatamente l'RNA appaiato con catene di DNA (l'H sta a significate ibrido, Hybrid RNA:DNA). La rimozione dell'RNA primer lascia nel DNA uno spazio a singolo filamento (gap) che è un substrato ideale per la DNA polimerasi: un complesso innesco:stampo. La DNA polimerasi riempie questi gap fino a che non si ricostruisce un doppio filamento, formando così un DNA completo eccetto per l'interruzione di un legame fosfodiesterico fra il terminale 3'-OH e quello 5' del fosfato sul filamento riparato. Questa interruzione (nick) può essere eliminata da un enzima: la DNA ligasi, che utilizza ATP per creare il legame fosfodiesterico.