Il meccanismo d'azione della DNA polimerasi

La sintesi del DNA è catalizzata da un enzima chiamato DNA polimerasi. A differenza della maggior parte degli enzimi, che posseggono un sito dedicato per ogni singola reazione, la DNA polimerasi utilizza un unico sito attivo per catalizzare l'aggiunta di tutti e quattro i deossinucleosidi trifosfati. La DNA polimerasi possiede questa flessibilità catalitica che permette di tener conto della identica geometria che caratterizza le coppie di basi A:T e G:C. Quindi, questo enzima, controlla la capacità de nucleotide che deve essere polimerizzato di formare le coppie aventi un ingombro sterico identico come lo sono quelle A:T o G:C piuttosto che verificare la correttezza del nucleotide che entra nel sito attivo. Soltanto quando si forma una corretta coppia di basi il 3'-OH dell'innesco ed il fosfato in α del nucleotide che deve essere polimerizzato si trovano in una posizione ottimale per la formazione del legame fosfodiesterico. Le DNA polimerasi, inoltre, mostrano un'impressionante abilità nel distinguere fra ribo- e deossinucleotidi trifosfati. Nonostante i ribonucleotidi siano, nella cellula, approssimativamente dieci volte più concentrati dei deossi-, essi sono incorporati ad una velocità che è 1000 volte più bassa. Questa discriminazione è mediata da un esclusione di carattere sterico che coinvolge il sito attivo della polimerasi. Infatti, nella DNA polimerasi, il sito di legame al nucleotide è troppo piccolo per permettere la presenza di un 2'-OH sul nucleotide che deve essere polimerizzato.
Una spiegazione molecolare di come la DNA polimerasi catalizzi la sintesi del DNA emerge dagli studi della struttura atomica di varie DNA polimerasi mentre legano il complesso innesco:stampo. Queste strutture rilevano che il DNA substrato si pone in un grande spazio che assomiglia ad una mano destra parzialmente chiusa. Per analogia i tre domini che formano la polimerasi vengono chiamati: pollice, dita e palmo. Il palmo è composto da un foglietto β e contiene gli elementi principali del sito catalitico. In particolare, questa regione della DNA polimerasi lega due ioni bivalenti (di norma Mg2+ o Zn2+) che modificano dal punto di vista chimico l'ambiente attorno alle basi appaiate e il 2'-OH dell'innesco. Infatti, uno ione metallico riduce l'affinità del 3'-OH per il suo idrogeno, generando un 3'-O- necessario per l'attacco nucleofilico del fosfato in α del nucleotide che deve essere polimerizzato. Il secondo ione stabilizza, invece, il pirofosfato prodotto durante la reazione, schermando anche le cariche negative del dNTP . In aggiunta del suo ruolo catalitico, il palmo controlla anche l'accuratezza dell'appaiamento delle basi che sono appena state polimerizzate. Infatti, questa regione della polimerasi forma con le coppie di basi numerosi legami idrogeno. Appaiamenti scorretti abbassano drasticamente la velocità di polimerizzazione. La ridotta velocità di catalisi, unita ad una ridotta affinità per il DNA neosintetizzato, permette il rilascio dell'innesco:stampo da parte del sito attivo polimerizzante della DNA polimerasi ed il legame ad un sito con attività nucleasica con funzioni di lettore e correttore di bozze. Le dita sono anch'esse importanti per la catalisi. Infatti, alcuni residui amminoacidici localizzati all'interno delle dita legano i dNTP (deossinucleotiditrifosfato) che devono essere polimerizzati. Inoltre, una volta che si è formato un corretto appaiamento, le dita si muovono per racchiudere e trattenere il dNTP. Le dita entrano in contatto anche con la regione dello stampo piegando di circa 90° il legame fosfodiesterico che si trova immediatamente dopo il sito catalitico. Questa curvatura, permette di esporre, al sito attivo, soltanto la prima base dello stampo che si trova dopo l'innesco. Questa conformazione dello stampo elimina qualsiasi confusione nella scelta del nucleotide che deve essere polimerizzato. Al contrario delle dita e del palmo, il pollice, invece, non è direttamente coinvolto nella catalisi. Questo serve a due scopi: primo, mantiene in corretta posizione l'innesco ed il sito attivo; secondo, stabilizza il complesso fra la DNA polimerasi ed il substrato. Questa associazione contribuisce ad aumentare la capacità della DNA polimerasi nell'aggiungere molti nucleotidi tutte le volte che si lega al complesso innesco:stampo.
Comunque, la catalisi mediata dalla DNA polimerasi è un evento rapido. Le DNA polimerasi sono capaci di polimerizzare circa 1000 nucleotidi al secondo. La velocità di sintesi è principalmente dovuta alla natura processiva dell'enzima. La processività è una caratteristica degli enzimi che hanno come substrato dei polimeri. Nel caso della DNA polimerasi, il grado di processività viene definito come il numero medio di nucleotidi polimerizzati dall'enzima nell'unità di tempo. Ogni DNA polimerasi è caratterizzata da una propria processività che può variare da pochi nucleotidi a più di 50000 basi aggiunte ogni volta che l'enzima di poggia sullo stampo. La polimerizzazione viene di molto aumentata una volta che l'enzima è riuscito a legarsi al complesso innesco:stampo, di fatto questo è l'evento che può limitare l'efficienza della DNA polimerasi. Un ulteriore aumento della processività è reso possibile dall'interazione della polimerasi con una proteina sliding clamp che ha funzione di trascinare la polimerasi stessa. Questa proteina ha una struttura ad anello e, quando legata, circonda il DNA.
Una certa limitazione della precisione della DNA polimerasi è data dalla occasionale (1 volta ogni 105) trasformazioni di una base in una forma tautomerica errata (iminica o enolica). Queste forme alternative delle basi determinano degli errori che necessariamente devono essere rimossi. La possibilità di correzione del DNA neosintetizzato è mediata dalla presenza di nucleasi che rimuovono le basi scorrette. Questo tipo di nucleasi è stato inizialmente identificato come attività associata alla stessa DNA polimerasi ed è conosciuto con il nome di esonucleasi correttore di bozze (proofreading exonuclease). Questo tipo di esonucleasi è capace di demolire il DNA a partire dal terminale 3' OH, cioè dal punto in cui la nuova catena di DNA si sta allungando. (Le nucleasi che idrolizzano il DNA a partire da un'estremità della molecola vengono dette esonucleasi; le nucleasi che invece tagliano all'interno il filamento di DNA sono chiamate endonucleasi). La rimozione dei nucleotidi errati è facilitata dalla ridotta capacità dell'enzima stesso di aggiungere successivi nucleotidi ad una coppia di basi che non rispetta il principio di complementarietà, in quanto gli errori alterano la geometria del 3'-OH che serve per continuare la sintesi. Quindi quando viene aggiunto un nucleotide non corretto diminuisce la velocità di polimerizzazione, mentre aumenta quella di correzione dell'errore da parte dell'attività esonucleasica. Comunque, la correzione degli errori non richiede l'allontanamento del DNA dalla tasca catalitica, in quanto la coppia di basi errata scivola dal sito attivo della DNA polimerasi e si avvicina al sito che contiene l'attività esonucleasica. Bisogna, inoltre ricordare che l'esonucleasi correttore di bozze agisce in direzione 5'→3', la stessa della replicazione, in quanto, la direzione opposta porterebbe, dopo l'eliminazione del nucleotide errato ad un terminale che possiede un solo fosfato e quindi non ha energia necessaria per legare successivamente il nucleotide corretto. Comunque, questo meccanismo di correzione abbassa la presenza di errori a uno ogni 107. Ulteriori processi di riparazione faranno abbassare questo numero.