La topologia del DNA

Questo DNA circolare covalentemente chiuso viene indicato come una struttura topologicamente definita. Anche le molecole di DNA lineari presenti nei cromosomi eucariotici sono sottoposte a costrizioni topologiche per via dell'estrema lunghezza della molecola che viene ridotta attraverso la formazione della cromatina e l'interazione con altri componenti cellulari. Se torniamo a considerare le proprietà topologiche dei DNA circolari covalentemente chiusi (cccDNA), possiamo definire con il termine linking number, o numero di legame topologico, il numero di volte che un filamento deve essere passato attraverso l'altro filamento affinché le due catene possano separarsi l'una dall'altra. Questo parametro, il linking number è la somma di due componenti geometriche, il twist (avvolgimento) ed il writhe (superavvolgimento). Il primo è semplicemente il numero di volte che un filamento gira intorno all'altro filamento. Se consideriamo un cccDNA con struttura planare, cioè che giace su un piano, il linking number è uguale al twist. In questo caso il numero di twist può essere facilmente determinato contando il numero di volta che i due filamenti si incrociano su se stessi. Il modo in cui i due filamenti si incrociano (twist) in una doppia elica destrogira è definito positivo: in questo caso il linking number avrà un valore positivo. Però i cccDNA normalmente non hanno una conformazione planare, ma presentano generalmente delle tensioni torsionali che impongono all'asse longitudinale della doppia elica di incrociarsi su se stessa, a volte anche ripetutamente, determinando così una struttura tridimensionale. Questo incrocio viene definito writhe. Quest'ultimo può presentarsi in due forme diverse: una, la così detta interwound o writhe plectonemico, in cui l'asse longitudinale della doppia elica è avvolto su se stesso; l'altra forma è un toroide o spirale in cui l'asse longitudinale è avvolto come attorno ad un cilindro e normalmente si ha quando il DNA si avvolge attorno ad una proteina. Quindi, il numero di writhe (Wr) rappresenta il numero di incroci dell'asse longitudinale su se stesso e/o il numero di spirali nel cccDNA. Esiste una sola limitazione: la somma del numero di twist (Tw) e del numero di writhe (Wr) deve essere sempre uguale al linking number (Lk): Lk = Tw + Wr. Ad esempio, se consideriamo un cccDNA privo di superavvolgimenti (che abbiamo definito rilassato) il suo twist corrisponde a quello del DNA in forma B in condizioni fisiologiche (circa 10,5 paia di basi per giro d'elica). Il linking number (Lk) di questo DNA è indicato dal simbolo Lk0. Lk0 per questo DNA è pari al numero delle paia di basi contenute nel DNA diviso 10,5. Per un cccDNA di 10500 paia di basi Lk sarà uguale a +1000 (il segno è positivo poiché il DNA è avvolto in senso destrogiro). Gli eventuali superavvolgimenti presenti su un cccDNA non rilassato, invece, possono essere rimossi con l'enzima Dnasi I, che idrolizza uno, o pochi, legami fosfodiesterici in ciascuna molecola. Una volta che il DNA è stato interrotto, ovvero si forma un nick (per nick si intende l'interruzione di un legame fosfodiesterico su un solo filamento della doppia elica) esso non è più topologicamente costretto e i due filamenti possono liberamente ruotare l'uno rispetto all'altro. Se il nick viene riparato, il cccDNA sarà rilassato ed avrà un Lk uguale a Lk0. La quantità di superavvolgimenti di un cccDNA è come la differenza esistente fra Lk e Lk0: questa differenza viene chiamata differenza linking: Δlk = Lk – Lk0. Se il Δlk di un cccDNA è diverso da zero la molecola è sottoposta a torsione e quindi si presenta superavvolta, se è minore si zero è superavvolto negativamente se invece è maggiore di zero la molecola è superavvolta positivamente. Poiché, però, Δlk e Lk0 sono dipendenti dalla lunghezza del DNA, è più semplice esprimere il superavvolgimento della molecola come densità di superelica a cui viene assegnato il simbolo σ ed è definita come: σ = Δlk/Lk0. Le molecole di DNA circolare sia batteriche che eucariotiche sono normalmente superavvolte negativamente con un valore di σ di circa -0,06. In questo modo, nei DNA superavvolti la separazione dei due filamenti è più favorita piuttosto che nel DNA rilassato. Il DNA nel nucleo delle cellule eucariotiche è compattato in piccole particelle conosciute come nucleosomi in cui la doppia elica è avvolta per circa due giri attorno ad un nucleo proteico. Questo tipo di avvolgimento non è altro, dal punto di vista geometrico, che un toroide o spirale che si avvolge con un andamento levogiro. Il linking number di questi superavvolgimenti può essere cambiato solamente provocando una interruzione dei legami fosfodiesterici di almeno una delle due catene del DNA. Una categoria di enzimi, conosciuti come topoisomerasi, sono in grado di introdurre una rottura del singolo o del doppio filamento del DNA in modo temporaneo. Le topoisomerasi appartengono a due classi principali: le topoisomerasi II permettono di cambiare il numero di legami di due unità per volta determinando una rottura temporanea dei due filamenti del DNA attraverso la quale può passare un tratto di elica integra, prima che il taglio venga risaldato. Le topoisomerasi I, invece, permettono di cambiare il numero di legame di un'unità per volta. Esse producono una rottura a singolo filamento della doppia elica, permettendo in questo modo al filamento integro di passare attraverso la rottura dell'altro prima che il nick venga eliminato. Il taglio della molecola di DNA avviene quando un residuo di tirosina presente nel sito catalitico dell'enzima attacca un legame fosfodiesterico dell'impalcatura della molecola di DNA bersaglio. Questo attacco causa una rottura del DNA in seguito alla formazione di un legame covalente tra la topoisomerasi e un terminale fosfato del nick e la tirosina. L'altra estremità del nick, che termina con un gruppo OH, è tenuta molto saldamente dall'enzima. Il legame fosfo-tirosina conserva l'energia che viene liberata dall'idrolisi del legame fosfodiesterico. Di conseguenza, il DNA può essere risaldato semplicemente tornando indietro nella reazione: il gruppo OH esistente al terminale del nick attacca il legame fosfo-tirosina riformando il legame fosfodiesterico del DNA. In maniera più dettagliata, dopo aver effettuato il taglio, la topoisomerasi è sottoposta ad un grande cambiamento strutturale che crea un'apertura sul filamento tagliato, con l'enzima che si pone a ponte sull'interruzione. Il secondo filamento di DNA non tagliato passa quindi attraverso l'apertura e si lega ad un sito interno simile ad un incavo della proteina. Avvenuto il passaggio, si ha un secondo cambiamento di struttura a carico del complesso topoisomerasi-DNA che porta indietro le estremità del filamento interrotto. La saldatura del filamento avviene, come dicevo prima, con l'intervento del gruppo OH sul legame fosfo-tirosina. Dopo questa reazione, l'enzima può aprirsi un'ultima volta per rilasciare il DNA.  Comunque, sia i procarioti che gli eucarioti posseggono topoisomerasi I e II che sono in grado di rimuovere i superavvolgimenti presenti sulle molecole di DNA. In aggiunta, però, i procarioti posseggono una speciale topoisomerasi II conosciuta come DNA girasi che introduce, invece di rimuovere, superavvolgimenti negativi. La DNA girasi è responsabile del superavvolgimento negativo dei cromosomi dei procarioti.
Le molecole di DNA circolari covalentemente chiuso aventi la stessa lunghezza ma linking number differente sono chiamate topoisomeri. Anche se i topoisomeri hanno la stessa grandezza molecolare possono essere separati l'uno dall'altro per elettroforesi su gel di agarosio. La base di questa separazione è che più elevato è il numero di writhe più compatta è la struttura del cccDNA. Ma più compattata è la molecola, più veloce è la sua migrazione attraverso la matrice del gel. Di conseguenza, un cccDNA completamente rilassato migra molto più lentamente di un suo topoisomero fortemente superavvolto. Un altro metodo per visualizzare il DNA superavvolto è l'utilizzo dell'etidio, un catione formato da più anelli aromatici che avendo una struttura planare riesce a scivolare e intercalarsi tra le coppie di basi impilate l'una sull'altra del DNA. Poiché esso è fluorescente quando esposto alla luce ultravioletta, l'etidio viene utilizzato come colorante per per visualizzare il DNA. Quando, però, lo ione etidio si intercala fra due coppie di basi, causa al DNA uno srotolamento della doppia elica di 26° riducendo di conseguenza il twist. Quindi, in un DNA circolare diminuendo il twist automaticamente si aumenterà il writhe, poiché il linking number non cambia (Lk = Tw + Wr). In altre parole, all'aggiunta dell'intercalante avremo un DNA più rilassato. Se la quantità di etidio aumenta, il numero di superavvolgimenti potrà raggiungere lo zero; aumentando ancora la quantità di etidio Wr diventerà maggiore di zero ed il DNA conseguentemente diventerà superavvolto positivamente. Naturalmente l'etidio modificherà anche, come ben si può capire, la migrazione elettroforetica.