Metodi di solubilizzazione

La cellula vivente è un'entità straordinariamente complicata, che produce migliaia di macromolecole e che ospita un genoma che può variare da milioni a miliardi di paia di basi. La comprensione del funzionamento dei processi genetici della cellula richiede approcci sperimentali potenti ed integrati, incluso l'uso di organismi modello adatti, in cui sia possibile fare uso dell'analisi genetica. Tali approcci includono anche metodi per la separazione di singole macromolecole dalle miscele cellulari e la dissezione del genoma in frammenti sufficientemente piccoli da essere manipolati ed analizzati a livello di sequenze di DNA specifiche. Comunque, in generale, ogni molecola, sia essa proteina, acido nucleico o carboidrati, può essere separata dalle altre molecole in base alle differenze di qualche caratteristica fisica. La prima tappa del procedimento di isolamento di una proteina o di qualsiasi altra molecola biologica è quella di portarla in soluzione. In alcuni casi, come per le proteine del siero sanguigno, la natura ha già svolto per noi questo lavoro. La maggior parte delle proteine deve però essere liberata dalle cellule che la contiene. Se la proteina che ci interessa è localizzata nel citoplasma della cellula, la sua liberazione richiede soltanto l'apertura (lisi) della cellula. Il metodo più semplice e meno traumatico per ottenere ciò è quello noto come lisi osmotica, in cui la cellula viene posta in una soluzione ipotonica, cioè in una soluzione in cui la concentrazione totale dei soluti è più bassa di quella presente nella cellula in condizioni fisiologiche. Sotto l'influenza della forza osmotica, l'acqua diffonde nella soluzione intracellulare più concentrata, causando il rigonfiamento e l'esplosione della cellula stessa. Questo metodo è particolarmente idoneo per le cellule di origine animale, ma è inefficace con le cellule che possiedono parete cellulare come i batteri e le cellule vegetali. In questi casi è più efficace l'uso di un enzima come il lisozima che degrada chimicamente la parete cellulare dei batteri. Per altri tipi cellulari, invece, vi è bisogno di una sorta di distruzione meccanica. Questi trattamenti comprendono la macinazione in presenza di sabbia o di allumina, di una pressa oppure di della sonicazione, con cui le cellule vengono rotte dalle vibrazioni ultrasoniche. Una volta che le cellule sono state rotte, il lisato grezzo può essere filtrato o centrifugato per allontanare le parti di cellule ancora intatte, lasciando quindi la proteina che ci interessa nel sopranatante. Se questa proteina è una componente di struttura subcellulare come la membrana o i mitocondri, è possibile ottenere un notevole grado di purificazione della proteina in esame separando per prima cosa la struttura subcellulare da tutto il materiale cellulare. Ciò può essere effettuato mediante la centrifugazione differenziale, un processo un cui il lisato cellulare viene centrifugato ad una velocità che determina la sedimentazione soltanto dei componenti cellulari più densi, seguita da una seconda centrifugazione che sedimenta gli organelli meno densi.  Esistono vari tipi di centrifughe ma i più comuni sono ad angolo fisso o quelle basculanti. A questo punto nel caso la proteina sia saldamente legata alla membrana viene solubilizzata, dal componente cellulare purificato mediante detergenti o con solventi organici, come il butanolo e il glicerolo, che solubilizzano i lipidi. Un altro modo per separare le macromolecole in base al loro peso molecolare è quello della stratificazione, in cui il materiale da analizzare viene caricato sopra un gradiente di un sale o di saccarosio. In questo modo, dopo un ciclo di centrifugazione, il campione par arrivare in fondo alla provetta passerà attraverso un gradiente di concentrazione e si stratificherà. Quindi le componenti più pesanti si troveranno in basso e quelle più leggere in alto. Se poi buchiamo il fondo, vedremo uscire prima le componenti con peso molecolare maggiore e così via, fino a quelle più leggere. Per esempio, quando vogliamo estrarre del DNA batterico, per prima cosa facciamo crescere i batteri in un brodo di coltura per poi romperle con una lisi, ad esempio, con NaOH. A questo punto per prelevare solo il DNA e separarlo dai contaminanti (RNA e proteine) o utilizziamo molecole come l'RNAsi per degradare l'RNA e altre molecole per le proteine oppure, il metodo più usato, è l'estrazione con fenolo. Il fenolo è un solvente apolare che non essendo solubile in acqua, in provetta va a formare, essendo più denso, una fase in cui le proteine, essendo costituite sia da amminoacidi polari che apolari, si stratificano tra il fenolo e l'acqua, esponendo le parti apolari verso il fenolo e quelle polari verso l'acqua. In questo modo prelevando solo lo strato acquoso avremo solo l'RNA e il DNA. Se, poi, aggiungiamo l'etanolo, il DNA precipita sempre dopo centrifugazione. Aspetteremo che l'etanolo evapora, per avere solo il DNA batterico.