Silenziamento genico post trascrizionale - interferenza dell'RNA - e miRNA

Per anni i biologi molecolari hanno usato RNA antisenso per inibire selettivamente l'espressione genica in cellule viventi. All'inizio, la logica era che l'RNA antisenso, complementare all'mRNA, si appaiasse all'RNA per inibire la traduzione. La strategia solitamente funziona, ma la logica era fallace. Nel 1995, infatti, alcuni scienziati stabilirono che l'iniezione di RNA di senso nelle cellule funzionava altrettanto bene di quella di RNA antisenso nel bloccare l'espressione di un particolare gene. Poi nel 1998, Andrew Fire e i suoi colleghi mostrarono che RNA a doppio filamento (dsRNA) funzionava ancora meglio sia dell'RNA di senso che di quello antisenso. Infatti, la ragione principale per cui gli RNA di senso e di antisenso funzionavano sembra essere che essi erano contaminati da (o producessero) piccole quantità di dsRNA, e che fosse il dsRNA, in realtà, a bloccare l'espressione genica. In più, i biologi molecolari cominciarono a notare che l'inserzione di transgeni in vari organismi induceva, a volte, effetti contrari a quelli desiderati. Invece di attivare il transgene, gli organismi spesso disattivavano non solo il transgene, ma anche la copia cellulare normale del gene. Questo fenomeno fu chiamato con diversi nomi: cosoppressione e silenziamento genico post trascrizionale (PTGS) nelle piante, interferenza dell'RNA (RNA interference, RNAi)  negli animali. Come sappiamo gli RNA eucariotici si dividono in: coding RNAs, che vanno ad essere processati per la produzione di proteine (2% degli RNA totali) e da non-coding RNAs, che invece non codificano per proteine ma sono coinvolti in molti processi come lo splicing (98% degli RNA totali).  Quest'ultima classe può essere ulteriormente suddivisa in large e small RNA che si differenziano a seconda del numero di basi. Nella classe degli small RNA fanno parte due RNA importanti definiti: siRNA e miRNA, che riescono a riconoscere la loro sequenza bersaglio attraverso complementarietà. Tutti gli siRNA e i miRNA delle piante, essendo molto piccoli 20-25 nt, vengono associati ad un complesso proteico detto RISC  che ne evita la degradazione. Successivamente riconoscono l'mRNA bersaglio e grazie a complementarietà si appaiano. A questo punto si ha il taglio dell'mRNA stesso che risulterà instabile e quindi verrà degradato. In questo modo i siRNA e miRNA, delle piante, impediscono l'espressione di un particolare gene grazie alla degradazione dell'mRNA prodotto.  I miRNa nell'uomo, invece, che sono protetti dalla degradazione dalla proteine miRNP, non si appaiano in maniera perfettamente complementare con l'mRNA bersaglio e quindi non si ha il taglio e la degradazione dell'mRNA stesso ma solo il suo silenziamento, bloccando la traduzione. Quindi i due meccanismi saranno distinguibili a seconda se la degradazione dell'mRNA è avvenuta oppure no. Invece, i rasiRNA, appartenenti sempre al gruppo degli small RNA, risultano complementari a regioni del promotore e permettono il reclutamento di enzimi che modificano la cromatina in maniera tale da silenziare il gene.  Come dicevamo, l'RNA interference è un novo meccanismo di regolazione dell’espressione genica che regola i livelli di un trascritto mediante : soppressione trascrizionale (trascriptional gene silencing, TGS) o degradazione dell’RNA mediante un processo sequenza specifico (post trascriptional gene silencing PTGS/RNA interference (RNAi).  Le osservazioni sperimentali furono primariamente riportate per il mondo vegetale e successivamente eventi di RNAi furono descritti in quasi tutti gli organismi eucariotici (protozoi, Drosophyla, nematodi, topi e linee cellulari umane). Intorno agli anni '80, alcuni scienziati volendo generare begonie con colori vivaci diversi inniettarono più copie geniche di pigmento. Essi videro, però, che all'aumentare dei geni che inserivano, le begonie reagivano diventando o sempre più bianche o sempre più viola o bianche e viola. All'inizio pensarono ad un errore nelle metodologie utilizzate ma successivamente scoprirono che l'RNA del transgene da loro iniettato non corrispondeva all'mRNA ricavato dalle piante ma era una “banda” molto corta, quindi pensarono fosse avvenuta degradazione. Quest'ultima ipotesi della degradazione però venne subito accantonata in quanto gli RNA trovati erano sì molto corti, circa 25 nt, ma nello stesso tempo molto stabili. Allora estrassero questo nuovo RNA e lo sequenziarono e notarono che questo particolare RNA era in grado di inibire sia il transgene che il gene endogeno. Contemporaneamente, a questo esperimento si vide anche che piante transgeniche che avevano incorporato il genoma del virus PVY, se sottoposta a nuova infezione non morivano. Successivamente si scoprì che questo virus a RNA produceva RNA capace di appaiarsi con l'RNA prodotto dalla stessa pianta.
Inoltre, Fire e i suoi colleghi mostrarono che iniettando le gonadi di C. elegans con dsRNA (il dsRNA iniziatore, o trigger) si causavano RNAi negli embrioni risultanti. Inoltre, essi rilevarono la perdita dell'mRNA (l'mRNa bersaglio) negli embrioni sottoposti a RNAi. La stessa cosa si osservò negli anni successivi sempre in C. elegans, dove quando veniva introdotto un dsRNA la proteina GFP non si esprimeva, e in Neurospora Crassa  dove si notava un fenomeno detto quelling (cambia solo il nome ma il meccanismo è lo stesso), dove l’introduzione di un transgene causa il silenziamento del gene omologo endogeno albino-1 (al-1), codificante per una proteina della via biosintetica dei carotenoidi. Quindi, il transgene causa la soppressione di entrambi i geni esogeno ed
endogeno. Comunque, in maniera più dettagliata, possiamo dire che i siRNA sono elementi a doppio filamento di circa 19 nt e non appaiati per tutta la loro lunghezza in quanto presentano il filamento 3' sporgente. Il meccanismo dell'RNAi, inizia con il taglio da parte dell'enzima Dicer del dsRNA, che come sappiamo può derivare da un genoma virale oppure da un transgene, in piccoli frammenti di 22 nt. Il taglio operato rilascia piccoli frammenti di siRNA che hanno estremità sfalsate. Una volta prodotti, questi pezzi di RNA vengono accorpati nel complesso RISC, in cui soltanto uno dei due filamenti viene conservato, mentre l'altro degradato. A questo punto, il filamento che trova complementarietà con l'mRNA indurrà la degradazione dello stesso mRNA.
La proteina Dicer presenta un dominio PAZ che riconosce l'estremità del dsRNA che si posiziona in sequenze ben precise dove avviene il taglio catalitico. Il dominio PAZ è stato riscontrato anche nelle proteine AGO che formano un complesso stabile per proteggere il dsRNA dalla degradazione. Quindi questo dominio è utile sia per il taglio che per il rivestimento. Nelle piante è presente anche la proteina RdRP, una polimerasi RNA dipendente che riconosce RNA e trascrive RNA. Nei mammiferi, invece, non abbiamo il silenziamento dovuto a dsRNA, in quanto le cellule sono in grado di riconoscerlo e considerarlo estraneo inducendo la via dell'apoptosi. Se questi dsRNA, però, risultano molto piccoli, su sequenze specifiche nell'uomo può avvenire il silenziamento di un solo mRNA senza indurre morte cellulare.

Il primo microRNA fu scoperto nel 1993 in C. elegans e solo nel 2003 si scoprirono anche nei mammiferi. In elegans si vide che questi miRNA erano coinvolti nella regolazione dello sviluppo. Infatti, furono trovati degli stadi larvali mutanti che non erano in grado di andare aventi nello sviluppo. Per questo, attraverso un test di complementazione, trovarono che vi era appunto complementazione nel gene lin-4 ma non riuscirono a trovare la proteina codificata. Pensarono dunque come intermediario, non più ad una proteina ma ad un RNA, per questo con effettuarono un Northen blot, trovando corte sequenze di RNA. Successivamente, si scoprì che questo RNA estratto faceva si che l'mRNA di lin-14 e lin-28 non venisse degradato e che quindi lo sviluppo non potesse procedere. Quindi si scopri che i miRNA si legano a mRNA specifici in maniera parziale, inducendo silenziamento genico. L'espressione dei miRNA nell'uomo, invece, è sito-specifica quindi non tutti gli stessi tessuti esprimono gli stessi miRNA. Comunque, tutti i microRNA che vengono prodotti, vengono trascritti dalla RNA polimerasi II nel nucleo formando uno stem-loop. Questo viene riconosciuto da due proteine: DROSHA e DGCR8. La prima funziona come Dicer, però non essendoci le estremità sfalsate, vi è bisogno di DGCR8 per crearle. Questo pre-miRNA viene quindi esportato nel citoplasma con le estremità 3' sfalsate e quindi viene tagliato da DROSHA ogni 22 nt. Successivamente come per il siRNA un filamento si lega al complesso RISC proteggendolo. A questo punto il miRNA, al contrario del siRNA, si lega parzialmente all'mRNA producendo solo silenziamento genico, ma non degradazione. Comunque, di solito i miRNA si legano al 3' ed esistono quattro modelli per il silenziamento: 1) inibendo l'attacco del ribosoma; 2) l'inizio può avvenire ma non l'allungamento; 3) il miRNA favorisce l'assemblaggio di enzimi di degradazione dell'mRNA; 4) il mRNA favorisce la degradazione del polipeptide nascente.