Malattia di von Willebrand: Espressione in vitro di varianti molecolari di tipo 2B e valutazione della interazione con la glicoproteina Ib, recettore piastrinico specifico del fattore di von Willebrand

La malattia di von Willebrand (VWD), descritta nel 1926, è la più frequente malattia emorragica ereditaria, anche se solo pochi individui affetti manifestano problemi clinici rilevanti. E’ causata da una riduzione o da un alterato funzionamento del fattore di von Willebrand (VWF), una glicoproteina multimerica ad alto peso molecolare che svolge un ruolo essenziale nell’emostasi primaria, intervenendo nell’adesione delle piastrine al sottoendotelio in seguito ad una lesione (legandosi al collagene ed al complesso recettoriale piastrinico GPIb-IX-V) e nell’ aggregazione piastrinica mediante l’interazione con il recettore piastrinico GPIIb/GPIIIa. Inoltre ha il compito di stabilizzare nel plasma il Fattore VIII, cofattore necessario nella cascata coagulativa.
Il VWF è codificato dall’omonimo gene di 178 Kb sul cromosoma 12 ed è sintetizzato dai megacariociti e dalle cellule endoteliali. La molecola (2813 aminoacidi) è organizzata in domini funzionali che permettono l’interazione con alcuni componenti della matrice sottoendoteliale, con i recettori piastrinici e con il Fattore VIII. Dopo una complessa biosintesi cellulare, il VWF viene secreto dalle cellule in forma multimerica e può raggiungere i 20 MDa.

La malattia di von Willebrand viene suddivisa in tre tipi principali. Un difetto quantitativo parziale del VWF nel plasma identifica il tipo 1 (trasmissione dominante), mentre il tipo 3 (trasmissione recessiva) è caratterizzato da livelli indosabili di VWF. Per quanto riguarda il tipo 2, sono stati identificati quattro sottotipi principali: il tipo 2A, caratterizzato dall’assenza di multimeri di VWF ad alto peso molecolare per un aumento della proteolisi plasmatica o della degradazione intracellulare; il tipo 2B, che presenta un incremento dell’affinità del VWF per il recettore piastrinico GPIb-IX-V; il tipo 2M, caratterizzato da un pattern multimerico normale ma con una ridotta capacità di legame alle piastrine; il tipo 2N, che presenta un difetto di legame al Fattore VIII.
In particolare, le mutazioni che causano la VWD tipo 2B sono distribuite in una regione ben localizzata del dominio A1 del VWF e consentono l’ingresso di molecole d’acqua nel dominio (il cambio conformazionale permette la formazione di un maggior numero di legami elettrostatici tra il VWF e il GPIb) oppure alterano il legame del VWF all’eparina, portando così ad una aumentata interazione con il GPIb.

Scopo dello studio: paragonare due varianti molecolari del VWF (due mutazioni differenti a carico dello stesso aminoacido: R1308) che causano la VWD tipo 2B. Non potendo utilizzare la proteina plasmatica, che nei due pazienti subisce un diverso destino, si è deciso di esprimere e produrre questi VWF ricombinanti, per comprendere meglio il fenotipo che causano.
Realizzati i vettori codificanti per il VWF con le due mutazioni di interesse, si sono espresse le proteine ricombinanti; la quantità prodotta (dosaggio VWF:Ag) per ciascuna variante è simile, così come pure il pattern multimerico.
Le varianti sono state successivamente valutate per la loro attività funzionale del legame al GPIb. Con il VWF:RCo – ELISA, è stata messa in luce la natura marcatamente iperaggregante della variante rVWF(R1308C), anche se i pazienti con tale difetto presentano un test RIPA molto vicino ai valori normali. Per contro, la variante rVWF(R1308L) mostra una affinità per il recettore GPIb incrementata rispetto al normale ma ridotta rispetto alla variante con la mutazione R1308C, anche se i pazienti con questo difetto presentano un RIPA iperaggregante. Spiegazione: nei pazienti con la R1308C i multimeri ad alto peso, aventi un’elevata affinità per il recettore piastrinico GPIb, si legano spontaneamente alle piastrine circolanti e vengono rimossi dal plasma; nel caso dei pazienti con la R1308L, i multimeri presentano una più alta affinità per le piastrine rispetto al normale, ma questo non è sufficiente affinché le forme ad alto peso leghino spontaneamente le piastrine. Le stesse indicazioni sono state ottenute nel caso delle coespressioni con la molecola wild type.
Un altro aspetto interessante è il comportamento delle due varianti nei confronti del collagene di tipo I. Il test del VWF:CB infatti ha mostrato come entrambe siano in grado di legare con minore efficienza questa molecola rispetto al wt. Questo risultato sembrerebbe conferire un ruolo più importante, rispetto a quanto riportato finora, del dominio A1 nel legame al collagene, almeno per quanto riguarda i test in vitro.