Il recettore dell'amaro hTAS2R46 e la modulazione del calcio intracellulare

Le MIDI preparazioni di DNA plasmidico sono state fatte a partire da colture batteriche di batteri E. Coli TOP10 trasformati con un plasmide contenente HTAS2R46 nativo, quattro plasmidi contenenti 4 SNP di interesse per questo studio: G749W, A457G, T422C, A439G, ed infine l’ultima contiene il plasmide pEGFP-N2 che sarà utilizzato come controllo positivo per la trasfezione. Il kit che è stato utilizzato è “Plasmid DNA purification by Macherey Nagel”.
Inizialmente occorre centrifugare la coltura batterica a 6.000 g per 15 minuti a 4°C in modo da separare i batteri dal terreno di crescita, si elimina il surnatante, si risospende il pellet in 8 ml di soluzione Resuspention Buffer trasferendolo successivamente in un tubo da 50 ml. Successivamente si lisano le cellule con 8 ml di Lysis Buffer avente colorazione blu, si inverte il tubo per cinque volte e si incuba a temperatura ambiente per 5 minuti. Mentre si aspetta il periodo di incubazione occorre caricare su una colonna il filtro “Nucleobond Xtra column filter” che verrà utilizzato per la purificazione; il filtro blocca le impurità più grossolane, la colonna presenta invece una resina di silice che cattura il DNA plasmidico. Si trasferiscono sul filtro 12 ml di Equilibration Buffer facendo attenzione a rilasciare lentamente la soluzione sulle pareti del filtro così che esso sia completamente bagnato. Conclusa l’incubazione si aggiungono 8 ml di Neutralization buffer al tubo contenente i batteri per neutralizzare il Lysis Buffer; invertendo il tubo la soluzione blu diventa trasparente, a questo punto è possibile caricarla sui bordi del filtro. Mentre la soluzione scende si fa il primo lavaggio con 5 ml di Buffer EQU, facendo attenzione di non far toccare il filtro al liquido che si deposita sulla resina. Una volta concluso il primo lavaggio, si deve togliere il filtro e procedere con il secondo lavaggio questa volta utilizzando 8 ml della soluzione di Wash Buffer rilasciandolo sulle pareti della colonna. Concluso anche il secondo lavaggio il DNA è legato alla resina, per staccarlo si utilizzano 5 ml di Eluition Buffer; si conserva questa soluzione in un tubo da 15 ml. In questa fase il DNA plasmidico è sciolto in soluzione e deve essere fatto precipitare, si aggiungono al tubo 3,5 ml di Isopropanolo, si centrifuga per 30 minuti a 4500 rcf a 4°C, si elimina il surnatante, si aggiungono 2 ml di etanolo 70% e si trasporta la soluzione in una provetta da 2ml, si centrifuga a 4500 rcf per 5 minuti a temperatura ambiente. Conclusa l’ultima centrifuga si elimina il surnatante e si lascia evaporare per un’ora sempre a temperatura ambiente, si aggiungono successivamente 100 ul di Buffer TE. Aggiunta la soluzione TE è possibile quantificare la concentrazione di DNA allo spettrofotometro (Nanodrop).
Allo spettrofotometro la concentrazione di DNA si legge con una lunghezza d’onda di 260 nm, gli zuccheri a 230 nm [15] e le proteine a 280 nm [15-16], ciò che occorre osservare sono i rapporti di concentrazioni 260/280 e 260/230. Il valore di 260/280 deve essere attorno all’1,8 e il valore di 260/230 deve essere di 2 [17], questo fatto indica che la concentrazione di DNA sia circa il doppio rispetto a quella di zuccheri e proteine e che quindi non sia contaminato da essi.