Screening biochimico e molecolare del gene HBB: confronto tra differenti metodologie di analisi

L’estrazione del DNA dei campioni analizzati è stata condotta con metodo automatizzato sullo strumento QIA Symphony®.
Per determinare la quantità e la purezza del DNA ottenuto dalle tecniche di estrazione fenolo/cloroformio o metodo automatizzato, si è utilizzato uno spettrofotometro UV-visibile (NanodropTm 2000) di ultima generazione che consente la misurazione accurata e rapida (meno di 5 secondi) di piccole quantità di campione (0.5 µl - 2.0 µl) senza l’ausilio di cuvette o capillari, sfruttando la tensione superficiale per mantenere il campione tra due fibre ottiche. L’apparecchio è controllato da un software installato su un pc ad esso collegato, che permette l’archiviazione dei dati. Lo strumento fornisce in modo automatico la concentrazione del DNA del campione.

Prima di procedere al dosaggio del DNA dei campioni, ottenuto mediante estrazione automatica, si effettua la calibrazione dello strumento posizionando 1,5 µl dello stesso buffer usato nella fase di eluizione direttamente sopra la superficie di rilevamento della fibra ottica. Abbassando il braccio dello strumento, un secondo cavo ottico viene messo in contatto col primo. Si crea così una colonna di campione a ponte tra le due fibre ottiche. Una lampada allo xeno fornisce la sorgente luminosa e uno spettrometro analizza la luce che ha attraversato il buffer e a seguire tutti i campioni, ottenendo così la concentrazione (in ng).

Lo strumento misura l’assorbanza del campione a 260 nm (lunghezza d’onda alla quale si ha l’assorbanza massima del DNA) e a 280 nm (dove si registra l’assorbanza massima delle proteine). La purezza del campione è indicata dal rapporto tra le letture a 260 e 280 nm, e il valore ottimale è compreso fra 1,8 e 2. Un altro rapporto che è tenuto in considerazione per valutare la contaminazione dei reagenti usati nella procedura di estrazione, e quindi l'efficienza di tale procedura, è quello tra l'assorbanza del DNA a 260 nm e quella a 230 nm dei fenoli, il cui valore ottimale è compreso tra 1,2 e 2,0.