Screening biochimico e molecolare del gene HBB: confronto tra differenti metodologie di analisi

Introduzione
Le emoglobinopatie comprendono un vasto gruppo di disordini genetici causati da alterazioni a livello dell'emoglobina; con una frequenza del 7% nella popolazione mondiale sono considerate le malattie monofattoriali più diffuse.
Le alterazioni a carico della molecola emoglobinica possono essere di tipo quantitativo o qualitativo: del primo gruppo fanno parte le sindromi talassemiche, del secondo le varianti strutturali, o emoglobine anormali. Le sindromi talassemiche che hanno maggiore rilevanza clinica sono le α- e β-talassemie, causate rispettivamente da mutazioni a carico dei geni per l'α- e la β-globina. Le varianti strutturali più frequenti sono rappresentate dalle emoglobine S, C ed E.

Scopo della tesi
Il confronto tra i risultati ottenuti con metodiche di biochimica clinica e quelli ottenuti con indagini genetiche in soggetti con sospetta emoglobinopatie/talassemia ha permesso di sottolineare come la qualità analitica possa essere validata dalla corretta interazione di metodologie di indagine diverse e di valutare, quindi, la loro utilità e le possibili implicazioni e applicazioni nella presa in carico del paziente.

Materiali e metodi
Su 31 campioni di sangue periferico si è condotto un primo screening in HPLC che ha permesso di determinare le frazioni emoglobiniche (fetale, glicata e A2) e di discriminare i campioni sani da quelli con emoglobine patologiche. Nei casi in cui non si sia ottenuto una corretta separazione ed identificazione delle varianti strutturali, è stata eseguita l'analisi in Elettroforesi Capillare. L' analisi molecolare del gene HBB è stata eseguita mediante sequenziamento diretto secondo il metodo Sanger.

Risultati
I risultati ottenuti con HPLC ed Elettroforesi Capillare sono stati confermati o chiariti dall'analisi delle sequenze. L'emoglobina variante S è stata riscontrata in 11 pazienti (6 allo stato eterozigote, 5 in omozigosi); la variante C in 2 pazienti, in entrambi allo stato eterozigote; la variante E in 2 pazienti, in uno in omozigosi, nell'altro in eterozigosi. In 2 pazienti è stata confermata la presenza di variante S ma esclusa la presenza di mutazioni riconducibili a β-talassemia; in 10 casi è stata confermata la presenza di mutazioni patogenetiche per β-talassemia; 2 campioni presentano eterozigosi composte ed infine in un paziente si è esclusa la presenza di mutazioni riconducibili a β-talassemia.

Discussione/Conclusioni
In questo lavoro abbiamo voluto presentare il confronto tra metodologie differenti in quanto l'obiettivo finale del laboratorio deve essere quello di fornire informazioni clinicamente utili riducendo al minimo i motivi di incertezza nella conclusione diagnostica e si è voluto sottolineare come la qualità analitica dipenda dalla corretta interazione di metodologie di indagine, compresa la valutazione genetica.