Genotipizzazione di accessioni di Phaseolus vulgaris L. mediante tecnologie di next-generation sequencing

L'innovativo approccio del genotyping-by-sequencing (GBS) è stato ideato come uno strumento a costi ridotti per studi di genetica di popolazione, caratterizzazione del germoplasma, miglioramento genetico e mappatura in organismi ad elevata diversità genetica (Elshire et al., 2011) e per i quali non esiste ancora un genoma di riferimento (organismi non modello). Il metodo si basa su tecnologie NGS ad elevato rendimento funzionale.
Il metodo GBS, nonostante sia stato pensato per piccoli genomi, si presenta come una tecnica versatile: i genomi ad elevata complessità vengono infatti sottoposti ad un trattamento di riduzione della stessa tramite digestione con enzimi di restrizione (ER) e successivo sequenziamento con le già citate tecniche NGS, un passaggio semplice, altamente specifico, riproducibile e in grado di raggiungere regioni del genoma che, con altre tecnologie, risulterebbero inaccessibili. Infatti, la scelta di ER appropriati può evitare il successivo sequenziamento di regioni altamente ripetute del genoma e migliorare l'efficienza della lettura di tratti con un numero ridotto di copie, semplificando sensibilmente l'elaborazione bioinformatica dei dati genetici in specie ad elevata diversità. Questo tipo di analisi permette di individuare dei polimorfismi, cioè differenze nella sequenza nucleotidica esistenti tra individui della stessa specie (Lorenzetti et al., 2011); in particolare, le tecnologie NGS permettono la scoperta di diverse migliaia di polimorfismi per singoli nucleotidi (single nucleotide polymorphisms, SNP), cioè polimorfismi che differiscono tra due individui per un solo nucleotide e che hanno una frequenza maggiore o al più uguale all'1% (Lorenzetti et al., 2011).
La tecnologia GBS per la scoperta di SNPs ha permesso di aggirare gli ostacoli della tradizionale genotipizzazione legati all'elevato costo e alla specificità dei marcatori nei confronti della popolazione sulla quale sono stati sviluppati: questo procedimento può essere infatti condotto direttamente sul DNA genomico in un singolo passaggio di sequenziamento, permettendo la costruzione di librerie genetiche quasi in parallelo (Davey et al., 2011).
Gli enzimi di restrizione sono uno strumento fondamentale delle tecnologie GBS: la loro elevatissima variabilità li rende estremamente versatili. Inoltre, nel sequenziamento di genomi vegetali la scelta opportuna di ER può semplificare notevolmente il procedimento: impiegando un ER sensibile alle basi metilate si possono escludere le regioni ripetute del genoma evitando di interagire con gli elementi ripetuti, per la maggior parte metilati (Davey et al., 2011).
Le diverse tecniche NGS impiegabili nel contesto di GBS hanno in comune i seguenti passaggi fondamentali:

1. Digestione di numerosi campioni di DNA genomico con attacco da parte di ER;

2. Selezione o riduzione dei frammenti di restrizione risultanti;

3. Sequenziamento del set finale di frammenti di restrizione, che dovrebbero avere una dimensione inferiore a 1 kb.

I polimorfismi ottenuti sono utilizzabili come marcatori molecolari (Davey et al., 2011).
La scoperta di un elevato numero di SNPs può vedere la propria efficienza incrementata grazie all'associazione di un sistema di barcoding al metodo NGS adottato, quale può essere il sequenziamento associato ai siti di restrizione (restriction-site associated DNA sequencing, RADseq); il codice a barre è localizzato appena a monte del sito di restrizione (Elshire et al., 2011).