Caratterizzazione delle cellule staminali tumorali nel carcinoma endometriale mediante analisi dell'antigene CD133 e saggi in vitro con cisplatino, doxorubicina e paclitaxel

Sezioni in paraffina di 3μm di carcinoma endometriale sono state sparaffinate con xilene 100% e reidratate con soluzioni scalari di etanolo. La perossidasi endogena è stata inibita ponendo le sezioni ad incubare con H2O2 per 5 minuti in camera umida a temperatura ambiente. Le sezioni sono state successivamente incubate con siero di capra al 20% per 30 minuti a temperatura ambiente, per ridurre i legami aspecifici (background). Dopo un lavaggio in PBS, le sezioni sono state marcate con l' anticorpo primario monoclonale anti- CD133 (clone AC133, Miltenyi Biotech; diluizione finale 1:50), mediante incubazione overnight a 4°C. In seguito a lavaggio in PBS, per eliminare l'anticorpo in eccesso non legato, le sezioni sono state marcate con l'anticorpo secondario enzima – coniugato, utilizzando il kit EnVision System-HPR (Dako Cytomation, Carpinteria, CA, USA). La reazione colorimetrica è stata effettuata, aggiungendo come cromogeno la 3,3 - Diaminobenzidina (DAB substrate System, Dako), che ha sviluppato un precipitato color marrone in corrispondenza del complesso Ag - Ab . Le sezioni sono state controcolorate con ematossilina, deidratate in soluzioni crescenti di etanolo e in xilene, e infine montate con Eukitt.