Studi di proteomica sulla cultivar di grano duro Simeto

 4
in ogni istante della vita di una cellula, di un tessuto o di un organismo, 
l’evoluzione di tale complesso sistema. 
La caratterizzazione e lo studio del complesso sistema proteico presente 
in una cellula comunque non è solo la naturale conseguenza del 
sequenziamento dei geni. Infatti ogni proteina non è la mera traduzione 
dell’informazione genomica, poiché, a causa di modifiche post-
trasduzionali, fenomeni di “differential splicing”, un singolo gene può 
esprimere in realtà una serie di proteine caratterizzate da una estesa 
micro-eterogeneità (Fig.1). 
 
Figura 1. Complessità dell’analisi proteomica. Un gene può produrre, nella fase di 
trascrizione, tramite “alternative splicing” più sequenze mRNAs. Dopo la 
traduzione, numerose modifiche post-trasduzionali possono generare larghe 
variazioni nel numero e nel tipo di forme proteiche. 
 
 5
Dalle precedenti considerazioni emerge chiaramente la difficoltà cui va 
incontro uno studio proteomico. L’avvento, negli ultimi anni, di tecniche 
ionizzazione soft, quali l’electrospray (ESI) e il 
desorbimento/ionizzazione laser assistita da matrice (MALDI), ha 
contribuito in modo determinante affinché la spettrometria di massa 
divenisse la tecnica leader nel campo della proteomica. L’accoppiamento 
della spettrometria di massa con tecniche ad alto potere risolutivo, quali 
l’elettroforesi bidimensionale (2D) su gel (SDS-PAGE) e la 
cromatografia su fase inversa (RP-HPLC) ha consentito di ottenere 
risultati un tempo impensabili, aprendo di fatto l’era della post-
genomica, quella della proteomica. 
In questo contesto, la “bioinformatica” è diventata parte integrante degli 
studi proteomici. Infatti, in un singolo esperimento si ottenengono 
generalmente una consistente quantità di dati, espressione della 
complessità di tali studi. Quindi, l’analisi dei dati ottenuti 
(bioinformatica) rappresenta uno step essenziale per l’identificazione 
delle proteine.
3 
L’insieme delle informazioni dedotte dagli studi proteomici, correlate 
con quelle ottenute a livello genomico, dovrebbe così consentire di 
stabilire l’effettivo ruolo sia delle proteine sia dei geni, nonché le 
relazioni genotipo-fenotipo. In tal senso, l’identificazione dei geni 
espressi fenotipicamente in un organismo in rapporto a un particolare 
 6
contesto temporale e spaziale dello sviluppo, definito dalla 
configurazione delle proteine presenti nella cellula, nonché la 
comparazione tra il proteoma di diverse cellule o della stessa cellula in 
tempi diversi, rappresentano oggi le nuove sfide conoscitive 
dell’indagine molecolare sulla vita. 
 
Il frumento 
 
I cereali rappresentano gli alimenti di più largo consumo presso i popoli 
di tutti i continenti e si ricavano da diverse piante appartenenti alla 
famiglia delle Graminacee. 
Tra i cereali il grano, o frumento, rappresenta il principale prodotto 
dell’agricoltura mondiale e la sua produzione è quasi interamente 
destinata all’alimentazione umana. 
Il frumento infatti oggi costituisce uno dei maggiori componenti delle 
diete nel mondo per la sua adattabilità agronomica, facilità di 
conservazione, bontà nutrizionale e possibilità di dar luogo, mediante 
trasformazione, ad una grande varietà di prodotti (pane, pasta etc.). 
Il frumento presenta variazioni considerevoli nella durezza e viene 
generalmente classificato in “Triticum vulgare o aestivum” e “Triticum 
durum”. 
 7
Il primo è il grano tenero con cariossidi friabili ed utilizzato nei processi 
di panificazione, il secondo invece è il grano duro utilizzato per la 
produzione della pasta. 
Il frumento e i suoi derivati costituiscono una importante risorsa 
nutritiva, essendo ricchi di fibre, carboidrati, proteine, vitamine, ferro, 
calcio, potassio, zinco, fosforo e magnesio. Le classi principali dei 
componenti presenti nella cariosside sono
4
: carboidrati (70 - 80% della 
farina disidratata), lipidi (1.5 - 2.5% della farina disidratata) e proteine (8 
- 18% della farina disidratata). Tra queste frazioni si ritiene che quella 
proteica sia la più importante nell’influenzare le caratteristiche 
reologiche dell’impasto del frumento, e per tale motivo da molti anni è 
oggetto di studio. 
 
 8
Le proteine del frumento 
 
La frazione proteica, secondo la classificazione di Osborne,
5,6
 che si basa 
sulla loro estraibilità in diversi solventi, può essere suddivisa in (Fig.2): 
ƒ Proteine metaboliche: albumine, globuline, etc. (estrazione in 
soluzione salina);  
ƒ Gliadine (estrazione in soluzione alcolica);  
ƒ Glutenine (estrazione in soluzione alcolica dopo riduzione dei 
legami disolfuro); 
ƒ Proteine del residuo (non estraibili con i solventi utilizzati).
2,3
 
La frazione proteica solubile in soluzione salina, che costituisce più del 
20% delle proteine totali, comprende principalmente le albumine e le 
proteine globulari con attività metabolica. Questa frazione è considerata 
di nessuna
7
 o solo di minore importanza
8
 nella determinazione delle 
qualità reologiche del frumento. 
Le rimanenti proteine hanno funzioni di riserva
9
 e sono generalmente 
indicate con il nome di prolammine. Tali proteine rappresentano più del 
50% del contenuto proteico totale nel seme maturo. Apparentemente la 
loro unica funzione è quella di essere una fonte di carbonio, azoto e zolfo 
durante la germinazione del seme. Le proteine di riserva del frumento, 
indicate come proteine del glutine, sono convenzionalmente divise in 
 9
gliadine, solubili in soluzioni alcoliche, e glutenine, solubili in soluzioni 
alcoliche solo dopo riduzione dei legami disolfuro. Questa differenza in 
solubilità è principalmente legata alla possibilità (nel caso delle 
glutenine) o meno (nel caso delle gliadine) di formare legami disolfuro 
inter-catena.
10 
 
 
 
 10
 
Figura 2. Classificazione delle proteine della cariosside del grano 
 
 
 
 
 
Proteine della cariosside del grano 
PROTEINE SOLUBILI IN ALCOOL
PROTEINE SOLUBILI IN ALCOOL E 
CONDIZIONI RIDUCENTI 
PROTEINE SOLUBILI IN 
SOLUZIONE SALINA 
(Proteine Metaboliche) 
GLIADINE 
HIGH MOLECULAR WEIGHT (HMW)
GLUTENINE 
Mobilità in SDS-PAGE
PROTEINE INSOLUBILI IN 
SOLUZIONE SALINA 
(Proteine di riserva) 
Mobilità in SDS-PAGE
 ∆-, Ε-Gliadine 
Mr 30-40 kDa, sei cisteine, 
tre legami disolfuro intra-
catena 
 ϑ-Gliadine 
Mr 30-40 kDa, otto cisteine, 
quattro legami disolfuro intra-
catena 
 Ζ-Gliadine 
 
M
r
 55-77 kDa, nessuna cisteina 
HMW di tipo x 
M
r 83-88 kDa, quattro 
cisteine, eccetto la subunità 
1Dx5 
HMW di tipo y 
Mr 67-74 kDa, sette cisteine 
LMW di tipo B 
M
r 42-51 kDa, di tipo 
m- e s-, numero pari 
di cisteine 
LMW di tipo C 
Mr 30-40 kDa, di tipo 
m- o  ∆-, Ε- e  ϑ-
gliadine modificate con 
una cisteina 
addizionale  
TERMINATORI di CATENA 
Mobilità in SDS-PAGE 
ESTENSORI di CATENA
Mobilità in SDS-PAGE 
LOW MOLECULAR WEIGHT (LMW)
LMW di tipo D 
Mr 55-77 kDa,  Ζ -
gliadine modificate con 
una cisteina addizionale 
RAMIFICATORI di CATENA 
 11
Le proteine del glutine 
 
Le proteine del glutine
11,12
 hanno una forte tendenza all’aggregazione 
poiché possono formare un elevato numero di legami ad idrogeno tra le 
catene laterali della glutammina e legami idrofobici tra le numerose 
catene laterali apolari. Sono generalmente insolubili vicino al loro punto 
isoelettrico (pH 6-9), poco solubili a pH basici, mentre sono 
moderatamente solubili a pH acidi. Queste caratteristiche di solubilità e 
di formazione di diversi tipi di legami tra le proteine, non ultimi i legami 
disolfuro inter- e intramolecolari, sono, presumibilmente, i principali 
fattori responsabili delle proprietà reologiche (viscosità, elasticità e 
coesione) che rendono il glutine adatto per i processi di panificazione. 
Le gliadine e le glutenine contribuiscono entrambe alla natura 
viscoelastica del glutine, anche se variazioni nella frazione gluteninica 
sembrano avere una maggiore importanza nel determinare le differenze 
di qualità tra diverse varietà di frumento. Le gliadine, infatti, sono 
coesive ma con bassa elasticità, mentre le glutenine sono sia coesive che 
elastiche. 
Da tali premesse emerge in modo chiaro il motivo per cui nel corso degli 
ultimi anni il complesso sistema proteico (gliadine e glutenine) che 
 12
costituisce il glutine sia stato oggetto di numerosi studi a livello 
molecolare, biochimico e biofisico.
13 
 
Le Gliadine 
 
Le gliadine, solubili in soluzioni alcoliche, sono proteine monomeriche 
che non contengono legami disolfuro o che presentano solo legami 
disolfuro intramolecolari. 
Tali proteine vengono classificate in base alla loro mobilità 
elettroforetica (SDS-PAGE) in tre sottogruppi (Fig.2): α/β-, con la più 
elevata mobilità, γ- e ω- gliadine.
14 
 Le α/β-gliadine e le γ-gliadine hanno 
pesi molecolari compresi tra 30 e 40 kDa, mentre alcune ω-gliadine 
possono raggiungere gli 80 kDa.
15 
Esse sono codificate dai geni dei loci Gli-1 e Gli-2, situati 
rispettivamente sui bracci corti dei cromosomi 1 e 6. 
La sequenza amminoacidica di molte α/β-gliadine, dedotta dalla 
sequenza del DNA,
7
 presenta tre regioni ben distinte (Fig.3): una corta 
regione N-terminale non ripetuta costituita da β-turns,
16,17
 seguita da una 
regione ripetitiva priva di cisteine che consiste di successioni, non 
necessariamente alternate, di due sequenze polipeptidiche (Pro-Gln-Pro-
Gln-Pro-Phe-Pro e Pro-Gln-Gln-Pro-Tyr) e, infine, la regione C-
 13
terminale principalmente con struttura ad α-elica,
13
 ricca di cisteine e 
contenente la maggior parte degli amminoacídi carichi.
18-21 
Le α/β-
gliadine contengono sei residui cisteinici e danno luogo alla formazione 
di tre ponti disolfuro intramolecolari. 
Analogamente, la sequenza ammimoacidica delle γ-gliadine può essere 
suddivisa in tre regioni (Fig.3): la regione N-terminale costituita 
generalmente da dodici residui con struttura secondaria a β-turns,
22
 
seguita da una regione ripetitiva basata sulla successione della sequenza 
polipeptidica Pro-Gln-Gln-Pro-Phe-Pro-Gln, ed infine la regione C-
terminale non ripetuta, che presenta una struttura secondaria ricca in α-
eliche,
23
 con pochi residui di prolina ma contenente tutte le cisteine e la 
maggior parte degli amminoacidi carichi. Tutte le γ-gliadine contengono 
otto residui cisteinici responsabili della formazione di quattro ponti 
disolfuro intramolecolari. 
Le ω-gliadine, infine, hanno pesi molecolari, dedotti da misure di SDS-
PAGE, compresi tra i 40 e 70 kDa. L’80% del totale degli amminoacidi è 
costituito da glutammina, acido glutammico, prolina e fenilalanina. 
La loro caratteristica principale è l’assenza di residui cisteinici nella 
struttura primaria.
24