Recettori metabotropici mGlu5 del glutammato e apoptosi neuronale in un modello di dolore neuropatico nel ratto

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trasmissione dello stimolo doloroso dalla periferia ai centri 
deputati alla sua decodificazione, non porta necessariamente 
all’esperienza dolorosa, la relazione che intercorre tra 
nocicezione e percezione del dolore nasce da un prodotto 
dell’elaborazione cerebrale degli inputs sensori a livello talamo-
corticale. 
L’alta natura soggettiva del dolore lo rende di difficile 
definizione ed anche il suo trattamento risulta complicato. Infatti, 
non esiste uno stimolo doloroso oggettivo in tutti gli individui: un 
esempio classico è quello di atleti infortunati che non 
sperimentano il dolore fin quando la competizione sportiva non è 
terminata. 
Il dolore è classificato come nocicettivo o neuropatico: il 
primo deriva dalla attivazione diretta dei nocicettori della pelle in 
risposta ad un danno tissutale ed è, di solito, accompagnato da 
infiammazione; il secondo deriva da un danno diretto ai nervi del 
sistema nervoso periferico o centrale. Tre sono le classi di 
nocicettori: 1) termici, attivati da temperature estreme e 
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presentano piccolo diametro; il segnale è condotto da fibre 
mielinizzate di tipo A-delta; 2) meccanici, attivati da una 
pressione intensa applicata alla pelle; anch’essi hanno fibre di 
tipo A-delta; 3) polimodali, attivati da intensi stimoli di natura 
meccanica, chimica o termica. Questi nocicettori hanno fibre 
poco mielinizzate, di piccolo diametro e note come fibre di tipo 
C. Queste classi di nocicettori sono ampiamente distribuite nella 
pelle e nei tessuti più profondi e spesso agiscono sinergicamente.  
In situazioni patologiche, l’attivazione dei nocicettori può 
portare a due tipi di stati dolorosi non fisiologici: l’allodinia e 
l’iperalgesia. 
L’allodinia è un dolore generato da stimoli che normalmente 
sono innocui; l’iperalgesia è una risposta eccessiva ad uno 
stimolo che già di per sé è di tipo doloroso. 
 
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1.2 Fisiologia del dolore 
Le fibre nocicettive afferenti terminano principalmente nelle 
corna dorsali del midollo spinale. Tali corna dorsali possono 
essere divise in sei zone (laminae) distinte sulla base dell’aspetto 
citologico e funzionale dei neuroni ivi residenti. Esiste, quindi, 
una precisa corrispondenza tra la funzionalità e l’organizzazione 
anatomica dei neuroni nelle corna dorsali spinali. 
Alcuni importanti neuroni nocicettivi sono localizzati nelle 
corna dorsali superficiali (laminae I e II). La maggior parte di 
questi neuroni ricevono inputs dalle fibre A-delta e C. I neuroni 
della lamina I rispondono esclusivamente alla stimolazione 
nocicettiva (neuroni nocicettivi specifici) e proiettano ai centri 
superiori del cervello. I neuroni della lamina II sono quasi 
esclusivamente interneuroni, sia eccitatori che inibitori.  
La trasmissione sinaptica tra fibre afferenti e neuroni dorsali 
è mediata da neurotrasmettitori chimici rilasciati dai terminali dei 
nervi sensori centrali. Il principale neurotrasmettitore eccitatorio 
rilasciato dalle fibre A delta e da quelle C, così come dalle fibre 
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afferenti non nocicettive, è il glutammato. Il rilascio di questo 
aminoacido evoca,  attivando i recettori del glutammato di tipo 
AMPA, potenziali post-sinaptici eccitatori nei neuroni delle 
corna dorsali. Le fibre afferenti primarie dei neuroni spinali 
mostrano anche lenti potenziali post-sinaptici eccitatori dovuti al 
release di trasmettitori di natura peptidica. I terminali delle fibre 
afferenti primarie di piccolo diametro nelle corna dorsali 
contengono sia vescicole sinaptiche che immagazzinano 
glutammato che vescicole per i neuropeptidi (Basbaum,1995). 
Tra i neuropeptidi presenti nei neuroni sensori nocicettivi, il più 
studiato è la Sostanza P, rilasciata dalle fibre C in risposta ad un 
danno tissutale o ad una intensa stimolazione dei nervi periferici. 
Il glutammato ed i neuropeptidi sono rilasciati dai terminali 
afferenti primari ed hanno ruoli distinti sui neuroni post-sinaptici, 
anche se agiscono in maniera coordinata nella regolazione 
dell’attività di tali neuroni. La sostanza P sembra potenziare e 
prolungare l’attività del glutammato. Il range d’azione dei due 
neurotrasmettitori può differire. Le azioni del glutammato sono 
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confinate ai neuroni post-sinaptici, nelle immediate vicinanze dei 
terminali sinaptici, come risultato di un efficiente re-uptake da 
parte delle cellule gliali (re-uptake 2) o degli stessi terminali 
neuronali (reuptake 1). Invece, i neuropeptidi possono diffondere 
a distanze considerevoli dal loro sito di rilascio poiché non esiste 
uno specifico meccanismo di re-uptake. Così, il rilascio di 
neuropeptidi da una singola fibra afferente può influenzare molti 
neuroni post-sinaptici nelle corna dorsali.  
In seguito a ripetute applicazioni di stimoli nocicettivi, i 
neuroni che precedentemente erano irresponsivi a tali stimoli, 
possono subire una modificazione fenotipica che li conduce ad 
essere responsivi. Tale variazione funzionale (sensitizzazione) in 
seguito a danno da compressione o da infiammazione, è dovuta al 
rilascio di vari agenti chimici da parte delle cellule e delle fibre 
nervose lesionate. Queste sostanze includono bradichinine, 
istamina, prostaglandine, leucotrieni, acetilcolina, serotonina e 
sostanza P (Fields, 1987). Ognuna ha origine da una differente 
popolazione cellulare, ma tutte agiscono diminuendo la soglia di 
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attivazione dei nocicettori. Alcune di esse, però, possono attivare 
tali recettori. Ad esempio, l’istamina rilasciata dalle cellule 
mastocitarie attivate (degranulazione) in risposta ad un danno 
tissutale attiva nocicettori polimodali. 
I neuroni nocicettivi primari regolano il loro microambiente 
mediante mediatori chimici, sintetizzati nel corpo cellulare e 
trasportati al terminale periferico, dove sono immagazzinati e 
rilasciati dopo la depolarizzazione del terminale.  
In condizioni di un danno severo e persistente, le fibre di tipo 
C sono sollecitate ripetutamente e la risposta dei neuroni delle 
corna dorsali aumenta progressivamente. Questo fenomeno, 
chiamato “wind-up”, è dipendente dal rilascio di glutammato 
dalle fibre C e conseguente apertura dei canali ionici post-
sinaptici (recettori ionotropi del glutammato di tipo NMDA). 
Infatti, il blocco di tale recettore previene il fenomeno del “wind-
up”.  
La stimolazione nocicettiva può produrre cambi a lungo 
termine nei neuroni delle corna dorsali. I recettori di tipo NMDA 
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prendono parte all’ipereccitabilità dei neuroni dorsali dovuta ad 
un danno tissutale. Questo fenomeno è chiamato sensitizzazione 
centrale.  
Queste variazioni a lungo termine nell’eccitabilità dei neuroni 
a livello delle corna dorsali rappresentano, quindi, una sorta di 
memoria del segnale indotta dalla superstimolazione delle fibre 
C. I neuroni che manifestano tale fenomeno della sensitizzazione 
hanno subito una induzione dei geni “precoci” che codificano per 
fattori di trascrizione, come c-jun, così come una upregulation 
nell’espressione dei neurotrasmettitori e dei loro recettori che 
presumibilmente modifica le proprietà fisiologiche di questi 
neuroni.  
Queste alterazioni nelle proprietà biochimiche e 
nell’eccitabilità dei neuroni dorsali possono portare 
all’insorgenza del dolore patologico, così come potrebbe giocare 
un ruolo primario nel diminuire la soglia della percezione del 
dolore.  
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1.3 Recettori metabotropici del glutammato 
Nel sistema nervoso centrale la maggior parte dell’attivazione 
sinaptica eccitatoria è mediata dall’interazione del glutammato 
con i propri recettori (Moroni, et al., 1998). Questo aminoacido 
eccitatorio può attivare sia recettori-canale (recettori ionotropi), 
che recettori associati a proteine G (metabotropi).  
I recettori canale sono complessi polimerici formati da 4-5 
subunità costituenti un canale ionico transmembrana. Sono 
classificati in tre categorie, differenti tra loro sulla base 
dell’agonista selettivo, delle cinetiche di attivazione e della 
permeabilità ionica: 1) recettori per l’acido alfa-ammino-3-
idrossi-5-metil-4-isoxazol-propionico (AMPA); 2) recettori per il 
kainato; 3) recettori per l’N-metil-D-aspartato (NMDA). I primi, 
permeabili allo ione Na
+
, sono presenti sulla membrana post-
sinaptica e sono responsabili della risposta eccitatoria 
depolarizzante rapida (tipica delle sinapsi glutammatergiche), 
infatti hanno cinetiche di attivazione/inattivazione dell’ordine dei 
millisecondi. I secondi, permeabili al Na
+ 
ed al K
+
, sono diffusi in 
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tutti il sistema nervoso centrale, ma la loro funzione non è ancora 
del tutto chiarita. Il terzo tipo di recettore presenta cinetiche di 
attivazione più lente (centinaia di millisecondi) ed è soprattutto 
permeabile al Ca
2+
. Il flusso di questo catione attraverso il 
recettore avviene solo se la membrana post-sinaptica è 
depolarizzata a tal punto da rimuovere il blocco che esercita lo 
ione Mg
2+
, inoltre la sua attivazione necessita di glicina come 
agonista. L’entrata dello ione calcio all’interno della cellula 
neuronale ha importanti conseguenze biologiche: si possono 
avere effetti trofici, regolatori e tossici (questi possono anche 
condurre a morte neuronale).  
 I recettori metabotropi per il glutammato (mGlu) sono 
associati a proteine G. Questi recettori sono classificati in tre 
sottogruppi: il primo comprende quei recettori che attivano il 
ciclo degli inositoli; il secondo quelli che inibiscono l’adenilato 
ciclasi; infine il terzo raggruppa quei recettori capaci di inibire 
l’adenilato ciclasi, ma che presentano agonisti selettivi diversi da 
quelli del secondo gruppo. I recettori di tipo metabotropico sono 
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diffusi in modo differenziale nel sistema nervoso centrale, 
possono coesistere nella stessa popolazione cellulare e 
probabilmente hanno un ruolo importante nei processi di 
integrazione centrale dei diversi input sensoriali. I recettori del 
primo gruppo (mGlu1 e mGlu5) sono localizzati sulle membrane 
post-sinaptiche, soprattutto in sede perisinaptica (Baude et al., 
1993), quindi probabilmente essi sono attivati solo dopo intense 
stimolazioni del terminale sinaptico, quando i sistemi di ricattura 
del glutammato sono saturati e non ne possono impedire più la 
diffusione negli spazi extra-sinaptici.  Questi recettori sono 
correlati all’idrolisi dei polifosfoinositoli (Nakanishi, 1994), un 
processo metabolico che conduce alla mobilizzazione 
intracellulare dello ione calcio, all’attivazione della protein-
chinasi C (PKC) ed alla formazione dell’inositolo-1,4,5-trifosfato 
(IP3) e del diacilglicerolo (DAG). 
L’attivazione dei recettori mGlu può causare un aumento 
della sensibilità dei recettori ionotropi, modulando positivamente 
le loro risposte.  
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 Concentrazioni elevate di glutammato, dell’ordine dei 
50-100 µM, possono provocare morte dei neuroni in coltura. 
Infatti, agonisti dei recettori glutammatergici applicati localmente 
nel sistema nervoso sono responsabili di una forma particolare di 
tossicità (eccitotossicità) in cui i neuroni mostrano segni di grave 
sofferenza a livello del soma e scarsi effetti tossici per la glia e le 
fibre nervose di passaggio. Questa  lesione è definita 
eccitotossica poiché è associata alla forte stimolazione eccitatoria 
dei neuroni. La morte neuronale da eccessivo accumulo di 
glutammato negli spazi extracellulari può avere sia le 
caratteristiche dell’apoptosi che quella della necrosi, a seconda 
della situazione metabolica delle cellule neuronali interessate. 
L’eccitotossicità è conseguente ad un abnorme accumulo di 
calcio citoplasmatico in seguito a superstimolazione 
glutammatergica. Tale elevata concentrazione di calcio può 
attivare, dopo una serie di eventi biochimici che vedono la 
partecipazione della PKC (Choi, 1992), enzimi litici, quali 
proteasi (tra cui le caspasi), lipasi, endonucleasi. 
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1.4 Teoria del Gate Control del dolore a livello spinale 
L’informazione di un danno ai tessuti è trasportata dal 
midollo spinale ai nuclei specifici del sistema nervoso attraverso 
cinque principali via ascendenti: spino-talamica, spino-reticolare, 
spino-mesencefalica, cervico-talamica, spino-ipotalamica. 
Il tratto spino-talamico è quello principalmente coinvolto 
(Willis, 1985). Esso comprende gli assoni dei neuroni nocicettivi 
specifici e quelli dei neuroni delle laminae I e V-VII delle corna 
dorsali. Questi assoni proiettano nel lato controlaterale del 
midollo spinale ed ascendono alle strutture sovraspinali lungo i 
funicoli anterolaterali e contraggono, infine, sinapsi con i neuroni 
talamici. 
Nel talamo i neuroni che costituiscono i gruppi nucleari 
laterali e mediali processano le informazioni nocicettive 
provenienti, tramite il tratto spino-talamico, dai neuroni delle 
laminae I e V. Danni al tratto spino-talamico provocano un 
dolore denominato dolore centrale.