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tecniche di mutagenesi e selezione fino a dare efficienti ceppi altoproduttori di proteasi e amilasi.
Ciò risulta particolarmente importante se si considera il fatto che le proteasi e le amilasi
costituiscono da sole circa la metà del mercato mondiale degli enzimi impiegati nell’industria, con
un fatturato stimato di oltre 600 milioni di dollari (3).
Se da un lato il maggiore interesse commerciale per Bacillus è dovuto agli enzimi da
impiegarsi in processi industriali, la continua attenzione verso questo gruppo microbico ha
delineato altri campi di applicazione, come: la produzione di nucleosidi, amminoacidi, vitamine,
antibiotici ed enzimi da impiegarsi nel campo delle moderne tecniche di biologia molecolare,
quali le endonucleasi di restrizione.
Sebbene gli streptomiceti rappresentino il gruppo microbico più studiato e sfruttato per
la produzione di antibiotici da impiegarsi in campo clinico, sono stati descritti ben 45 antibiotici
prodotti da ceppi di Bacillus: alcuni di questi hanno mostrato un valore clinico, altri vengono
impiegati in campo alimentare per prevenire contaminazioni microbiche negli alimenti, altri
ancora per controllare malattie nelle piante (4, 5). Un’altra importante proprietà che negli ultimi
anni è stata sfruttata commercialmente in modo sempre crescente è la capacità di alcuni ceppi
delle specie B. thuringiensis, B. popiliae, B. lentimorbus e B. sphaericus di sintetizzare
proteine con attività insetticida e, pertanto, vengono impiegati in campo agrario nel controllo di
alcuni insetti fitopatogeni (3). I biocomposti ad attività insetticida prodotti da questi
microrganismi presentano, rispetto ai loro corrispettivi chimici, vantaggi che possono essere
schematizzati qui di seguito:
-non sono dannosi per l’uomo, animali, piante;
-sono specifici solo verso particolari insetti;
-non inquinano;
-non danno origine a resistenza;
-non danno origine a prodotti di degradazione nocivi.
Non da ultimo bisogna ricordare che la resistenza al calore, alla disidratazione, ai raggi
UV e ad altri agenti fisici delle spore batteriche ha assunto, in campo industriale, una rilevante
importanza, in quanto vengono utilizzate come indicatori biologici per valutare l’efficienza dei
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metodi per la conservazione degli alimenti e della sterilizzazione di diversi prodotti e materiali,
come preparati farmaceutici, strumenti chirurgici, medici e di laboratorio (3, 6).
Al fine di comprendere appieno l’importanza di tale genere, nella Tabella 1 sono
presentati i ceppi di Bacillus con i loro prodotti commercialmente utili o le loro applicazioni.
Tabella 1: Specie di Bacillus e loro prodotti o applicazioni
Specie Prodotti o applicazioni
B. acidopullulyticus Pullulanasi
B. alcalophilus Amilasi (alcalina)
Proteasi (alcalina)
B. amiloliquefaciens α-amilasi
β-glucanasi
Proteasi
Ribonucleasi
B. aneurolyticus Tiaminasi
B. brevis α-acetolattato-decarbossilasi
Gramicidina
Tirocidina
B. circulans Amilasi (alcalina)
α-amilasi
Antibiotico Bu-1880
Antibiotico EM-49 complesso
Cellulasi
Ciclodestrina-glucosiltransferasi
Enzima che lisa la parete cellulare dei lieviti
Acido L-glutammico
Neuramminidasi
Polimixina F
B. coagulans D-acido lattico
DL-acido lattico
Xilosio-isomerasi
B. fastidiosus Uricasi
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B. licheniformis α-amilasi (termostabile)
Bacitracina
2,3-butandiolo
Acido citrico
Glicerolo
5'-idrossi-L-triptofano
Acido 5'-inosinico e inosina
Penicillinasi
Pentosanasi
(Tab. 1: continua)
B. licheniformis Proteasi (alcalina)
B. macerans Ciclodestrina-glucosiltransferasi
β-glucanasi
B. megaterium α-amilasi
β-amilasi
Fruttosio
Acido L-glutammico
Acido 2-cheto-L-gulonico
Guanosina e acido 5'-guanilico
Acido 5'-inosinico e inosina
L-lisina
Megacina
Derivati purinici
Urato-ossidasi
Vitamina B12 e B2
Xantosina
B. mesentericus Proteasi
B. mycoides Antibiotico 60-6
Maltosio
B. pasteurii Ureasi
B. polymyxa α- e β-amilasi
Antibiotico BN-109
Aspartochinasi
2,3-butilenglicol
Colistina
Gatavalina
Proteasi neutre
Acido pectico trans-eliminasi
Pentosanasi
Polimixina
(continua)
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B. pumilus Acido 5'-inosinico e inosina
Kristenina
Proteasi
D-ribosio
Acido xantilico
B. sphaericus Bioinsetticidi
Degradazione di erbicidi ureici
Ossidazione acido caproico
B. stearothermophilus α-amilasi (termostabile)
Ciclodestrina-glucosiltransferasi
Degradazione della penicillina
DNA polimerasi (termostabile)
Enzima che lisa la cellula dei lieviti
β-galattosidasi
(continua)
(Tab. 1: continua)
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B. subtilis Acido adenilico
α-amilasi
β-amilasi
L-arginina
Bacillina
Bacillomicina B
Bacitracina
Biotina
Citrullina
Ciclodestrina-glucosiltransferasi
Degradazione nitriti e cianuri
Diacetinasi
Acido diammino pimelico
β-galattosidasi
β-glucanasi
Acido-5-guanilico e guanosina
L-istidina
Ipoxantina
Inosina
Acido 5-inosinico e inosina
5'-nucleotidi
Orotidina
Pentosanasi
Proteasi
Penicillinasi
Derivati purinici
Riboflavina
D-ribosio
Subtilisina
Surfactina
L-triptofano
Urato-ossidasi
Xantosina
B. thermoproteolyticus Termolisina
B. thermoruber Antibiotici
Proteasi neutre
B. thiaminolyticus Tiaminasi
B. thuringiensis Bioinsetticidi
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1.1.1 : Prospettive future
Sempre più frequentemente si parla di biotecnologie microbiche e di microrganismi
ingegnerizzati in grado di produrre vantaggiosamente svariati prodotti. Per questi studi di
genetica microbica applicata è stato ed è tuttora utilizzato il sistema modello base rappresentato
da Escherichia coli. Tuttavia, a causa dei possibili inconvenienti dati dall’impiego di batteri
Gram negativi nelle procedure di ingegneria genetica, da qualche tempo l’attenzione dei
ricercatori è rivolta al modello B. subtilis.
I possibili vantaggi di tale scelta sono determinati dal fatto che:
-ha la capacità di secernere grandi quantità di proteine nell’ambiente extracellulare;
-non presenta sulla parete cellulare lipopolisaccaridi, che possono fungere da
determinanti antigenici;
-è riconosciuta la sua innocuità in campo alimentare da organizzazioni internazionali quali
la US Food and Drug Administration;
-i suoi processi fermentativi sono ben noti e caratterizzati.
Comunque, malgrado queste prerogative, le aspettative che i sistemi ospite-vettore di B.
subtilis si sarebbero dimostrati validi ed alternativi ad E. coli per la produzione di composti
terapeutici destinati all’uomo, sono state in gran parte disattese (3). Sebbene siano stati compiuti
diversi tentativi per ottenere prodotti di geni animali clonati in Bacillus, le rese sono state troppo
basse per un loro utilizzo pratico.
Perciò, l’interesse dell’industria biotecnologica orientata al campo farmaceutico per B.
subtilis è sfumato. Tuttavia le ragioni che hanno dettato la scelta dell’impiego di Bacillus non
sono mutate e rimangono tuttora valide; ciò che è cambiato è l’obiettivo.
L’enfasi corrente sull’applicazione biotecnologica di Bacillus è spostata sulla possibilità
di un loro utilizzo nella produzione di enzimi e di bioinsetticidi. In questi ultimi anni, particolare
interesse ha iniziato a riguardare l’ingegneria e la genetica delle proteine e, dalle premesse,
sembra che, in un prossimo futuro, questa branca della biotecnologia svolgerà un ruolo di primo
piano nello sviluppo di nuovi prodotti.
13
Mentre da un lato assisteremo al continuo sviluppo di programmi di selezione per nuovi
prodotti, dall’altro varianti ingegnerizzate di proteine già note assumeranno man mano un valore
commerciale sempre più rilevante. Alla luce di queste considerazioni, appare evidente che il
candidato più probabile possa essere Bacillus per la sua ampia variabilità produttiva.
Ciò sarà possibile solo se gli studi di base finora compiuti sulla regolazione
dell’espressione genica, sulla sporificazione, sullo sviluppo di idonei vettori e sulla secrezione di
prodotti esogeni continueranno a progredire.
Inoltre, un’approfondita conoscenza dei processi della secrezione potrebbe anche
consentire una riconsiderazione dell’impiego di Bacillus in quei settori dove non sono state
realizzate le aspettative desiderate.
14
1.2 : Bacillus licheniformis
Questo batterio, che spesso si presenta a catenelle, ha la particolarità di crescere in
colonie rugose con l’aspetto di lichene, da cui il nome.
Pur essendo una specie ubiquitaria, l’habitat primario di B. licheniformis è il suolo; qui
riveste un ruolo importante nel ciclo del carbonio e dell’azoto, anche perchè è un efficientissimo
denitrificante.
Dal punto di vista economico-industriale, B. licheniformis riveste un ruolo di primo
piano nella produzione di enzimi come α-amilasi termostabili (7, 8), proteasi (9-11), polimeri
dell’acido glutammico, biosurfactanti (4, 12), composti ad azione antibatterica ed antifungina (5)
ed ER (13).
L’importanza economica di questi prodotti si evince se si analizzano alcune cifre
riguardanti il mercato dei detergenti (9). Gli enzimi utilizzati per la formulazione dei detergenti
sono principalmente due alcalin-serin-proteasi: la subtilisina Carlsberg, prodotta da B.
licheniformis, e la subtilisina Novo, prodotta da B. amyloliquefaciens. La produzione annua
(relativa al 1993) ammonta a circa 1300-1500 ton, con un mercato di circa 300 milioni di
dollari. Appare perciò evidente l’interesse economico nei confronti di questa specie microbica
(3). Se poi si considera il fatto che B. licheniformis non è patogeno, che è di facile coltivazione,
che ha una velocità di crescita elevata e che nel 1989 il Ministero della Sanità danese ha
concesso per la prima volta la certificazione di sicurezza ambientale e l’autorizzazione
all’impiego a livello industriale di ceppi di questa specie sia naturali che geneticamente
modificati, si capisce perchè questa specie sia oggetto di attenzioni sempre crescenti da parte
della biotecnologia (14).
In campo alimentare, trattandosi di uno sporigeno, può essere assuto come indice di
efficienza dei processi di sanitizzazione termica degli alimenti, non ultimo il latte (15).
Un ulteriore impiego di B. licheniformis è costituito dalla possibilità di usarlo come
ospite nel clonaggio di geni che esprimono prodotti di rilevanza industriale (14).
15
Purtroppo in questi ultimi anni sono stati segnalati alcuni rari casi di intossicazioni
alimentari a seguito di ingestione di cibi preparati in maniera inadeguata (16) e di casi di infezioni
setticemiche (17), peritoniti e infezioni oculari (18) in soggetti immunodepressi. E’ stato inoltre
causa di endocardite in un anziano portatore di una valvola aortica artificiale (19).
Bisogna comunque rilevare che in tutti questi casi clinici B. licheniformis si è
comportato non da agente eziologico primario, ma come patogeno opportunista in pazienti
seriamente debilitati, già compromessi da altre infezioni.
Nonostante questi rari e sporadici casi, B. licheniformis è da ritenersi comunque un
organismo idoneo e sicuro dal punto di vista sanitario, tanto che le autorità statunitensi, europee
e giapponesi hanno approvato i processi industriali che impiegano ceppi sia naturali che
ricombinanti di B. licheniformis.
Non si deve comunque escludere la possibilità che possa aumentare l’incidenza di
malattie dovute a questo batterio, soprattutto in considerazione del diffondersi di virus, come
quello dell’AIDS, che espongono gli individui colpiti a ogni genere di infezione.
Ecco quindi che l’identificazione rapida e sicura di B. licheniformis assume, oltre
all’indubbio significato tassonomico e interesse biotecnologico, anche una valenza diagnostica
non secondaria.
16
1.3 : Caratterizzazione del DNA batterico
I tradizionali metodi di analisi, che si basano sull’osservazione morfologica, le richieste
nutrizionali e colturali, il metabolismo energetico e la resistenza agli antibiotici, sono i più diffusi
perchè di semplice esecuzione. Tuttavia, i metodi moderni di analisi genetica spesso sono più
sensibili e affidabili. E’ infatti di fondamentale importanza poter disporre di tecniche che
identificano i microrganismi senza possibilità di errore, in particolare per il monitoraggio di
ambienti specifici per controllare e prevenire malattie infettive e per l’individuazione di ceppi con
caratteristiche fenotipiche di interesse per il settore agroalimentare e ambientale.
Quelli di maggiore interesse sono riportati qui di seguito.
1.3.1 : Determinazione del % GC
Per calcolare la percentuale di guanina e citosina presenti nel genoma, si adotta la
seguente relazione:
%GC = (Tm - 69,3) / 0,41
dove Tm rappresenta la temperatura media di denaturazione del DNA. Tale valore viene
valutato grazie a uno spettrofotometro dotato di sistema riscaldante.
Se due microrganismi presentano valori simili di %GC apparterranno, con molta
probabilità, alla stessa specie. Il limite di questa tecnica è determinato dall’impossibilità di
distinguere ceppi della stessa specie; inoltre, non fornisce informazioni sulla sequenza
nucleotidica.
17
1.3.2 : Ibridazione DNA / DNA
Si applica a due organismi di diversa provenienza e consiste in una denaturazione del
DNA, seguita da un appaiamento selettivo incrociato dei singoli filamenti che determina il grado
di omologia genetica.
Le procedure che si possono seguire sono due. La prima si basa sulla misura della
velocità di riassociazione dei singoli filamenti di DNA, valutata spettrofotometricamente. La
seconda prevede la marcatura (di tipo radioattivo o fluorescente) del DNA di riferimento, la sua
ibridazione su membrana con il DNA da testare e la rivelazione della marcatura (20).
Uno degli svantaggi di questa tecnica è la sua complessità; inoltre, richiede una quantità
di materiale genetico superiore a quella necessaria per altre tecniche. Infine, necessitando di
DNA con un elevato grado di purificazione, l’estrazione dell’acido nucleico implica numerosi
passaggi.
1.3.3 : Analisi dei polimorfismi di restrizione
(RFLP: Restriction Fragment Lenght Polymorphisms)
Questa tecnica si basa sull’impiego di endodesossiribonucleasi di restrizione (ER), che
agiscono in modo mirato a livello di una specifica sequenza del DNA. La successiva
elettroforesi andrà ad evidenziare i frammenti prodotti dall’azione degli ER impiegati.
La RFLP è utilizzata nella costruzione di mappe genetiche e nella diagnosi di malattie
ereditarie.
18
1.3.4 : Ribotyping
Questa procedura permette di caratterizzare ceppi della stessa specie attraverso lo
studio dell’operone ribosomale e più precisamente degli spacer: questi sono regioni di DNA
non codificanti e si trovano tra il gene che codifica per la subunità ribosomale 16S e il gene che
codifica per la subunità ribosomale 23S.
OPERONE RIBOSOMALE
Figura 1: Struttura dell'operone ribosomale
Viene impiegata una sonda nucleica costituita dall’RNA ribosomale (16S+23S) di
Escherichia coli. Sintetizzato il corrispondente DNA complementare, grazie all’azione
dell’enzima trascrittasi inversa, questo viene marcato con digossigenina (reattivo che sviluppa
luminescenza in presenza di un idoneo substrato).
Contemporaneamente il DNA cromosomale allo studio viene digerito con enzimi di
restrizione; i frammenti ottenuti sono sottoposti a elettroforesi sul gel d’agarosio e quindi
trasferiti su membrana di nylon (Southern Blotting).
A questo punto, si fa ibridare la sonda nucleica marcata con i frammenti di restrizione;
l’ibridazione sarà poi rilevata per sviluppo di chemioluminescenza, grazie ad anticorpi anti-
digossigenina. Ciò permette di confrontare i profili elettroforetici dei microrganismi allo studio.
Questa procedura ha lo svantaggio di essere molto laboriosa.
16S rDNA tRNA 23S rDNA 5S rDNA
19
1.3.5 : La Reazione a Catena della Polimerasi (PCR)
La PCR (Polymerase Chain Reaction) è una rivoluzionaria tecnica di biologia
molecolare che permette la produzione, in poche ore, di grandi quantità di copie di un segmento
specifico di DNA (21).
Affinchè avvenga l’amplificazione, sono necessari due oligonucleotidi sintetici (primer).
Questi si legano alle estremità del frammento di DNA che sarà amplificato, in quanto vi trovano
le sequenze ad essi complementari. I primer, infatti, sono costruiti in modo tale che la sintesi del
nuovo DNA avvenga nella zona compresa tra essi.
Il procedimento di amplificazione avviene in tre fasi. La prima fase, di riscaldamento
(94°C), ha la funzione di denaturare il DNA da amplificare, cioè di separarne i due filamenti; la
seconda fase si svolge a una temperatura più bassa (circa 60°C) per permettere l’appaiamento
(“annealing”) dei primer alla sequenza bersaglio; l’ultima fase, di estensione (72°C), è quella in
cui avviene la sintesi del nuovo filamento di DNA, complementare al filamento che funge da
stampo. Ciò è possibile in quanto la procedura prevede l’aggiunta, alla miscela di reazione, di
DNA polimerasi che lega i deossiribonucleotidi all’estremità 3’ del primer, nell’ordine
predeterminato dal filamento stampo. Le tre fasi del processo di amplificazione sono
rappresentate in Figura 2.
Ripetendo più volte questo ciclo di denaturazione, appaiamento ed estensione è
possibile ottenere un aumento esponenziale del numero di copie. Il DNA appena sintetizzato,
infatti, si comporta esso stesso come templato nel ciclo successivo.
Nella Figura 3 viene rappresentata una serie di cicli.
20
dNTP: dATP, dTTP, dCTP, dGTP : DNA polimerasi
: Primer : DNA stampo
: Filamento di neosintesi
dNTP
5’
3’
5’
3’
dNTP
dNTP
dNTP
5’
3’
dNTP
dNTP
5’
3’
dNTP
5’
3’
dNTP
dNTP
5’
3’
dNTP
5’
3
dNTP
dNTP
5’
3
Denaturazione
termica
Appaiamento dei primer
Estensione
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