Determinazione Attività Antiossidante del Pane con Biosensore a Superossido Dismutasi

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È noto, ad esempio, che una dieta Mediterranea, ricca di antiossidanti naturali, 
porta ad una limitata incidenza di problemi cardiovascolari e neuro-
degenerativi. 
È perciò di particolare interesse ed attualità la determinazione di nuovi metodi 
analitici per la valutazione della capacità antiossidante dei diversi prodotti 
alimentari (frutta, verdura, etc. ). 
In aggiunta ai diversi metodi spettrofotometrici e voltammetrici noti in letteratura, 
recentemente è stato ideato un particolare metodo elettrochimico: il Biosensore 
a Superossido Dismutasi (SOD2), per la determinazione del radicale 
superossido (·O2-) [1-4].  
Tale Biosensore si è dimostrato adatto alla determinazione della capacità 
antiossidante di classiche specie quali fenoli, acido ascorbico, acido 
acetilsalicilico, β-carotene, glutatione, cisteina, etc., presenti in differenti 
matrici alimentari e farmaceutiche. 
Studi precedenti hanno ampiamente dimostrato come i risultati ottenuti con 
questo nuovo biosensore sono paragonabili a quelli ottenuti con metodi già 
affermati in letteratura (ORAC3, DMPD, etc.), evidenziando come il metodo 
sia valido, robusto, sensibile, pratico ed economico [5-7]. 
Il presente lavoro è suddiviso in due parti: una prima parte generale, Capitoli 
1-4 ed una seconda parte che riporta il lavoro sperimentale, Capitoli 5-7. 
                                                          
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 SOD: SuperOxide Dismutase 
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 ORAC: Oxigen Radical Absorbance Capacity 
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Nel Capitolo 1 si introduce la problematica relativa allo Stress Ossidativo, 
all’attività dei ROS ed ai meccanismi di difesa degli antiossidanti enzimatici e 
non-enzimatici. 
Nel Capitolo 2 si richiamano alcune considerazioni di carattere generale sui 
cereali, sulle farine e sul pane, evidenziando le proprietà di interesse ai fini 
della ricerca. 
Nel Capitolo 3 si introducono i Biosensori ed in particolare viene descritto il 
Biosensore a Superossido Dismutasi (SOD) utilizzato per la 
determinazione della capacità antiossidante dei campioni alimentari 
considerati. 
Nel Capitolo 4 vengono specificati i diversi scopi della ricerca, 
evidenziandone l’originalità.  
La seconda parte sperimentale si compone del Capitolo 5, in cui sono 
descritte le apparecchiature, gli elettrodi, i reattivi ed i materiali utilizzati, 
nonché il metodo di analisi, ed il Capitolo 6, in cui vengono riportati e 
descritti i dati sperimentali sintetici ricavati. Vengono altresì avanzate possibili 
spiegazioni dei risultati ottenuti in funzione della tipologia di matrice 
alimentare analizzata. 
Nel Capitolo 7 si riportano, invece, le considerazioni conclusive. 
Infine in Appendice sono riportate le misure di tutte le prove sperimentali 
eseguite. 
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L’attività sperimentale è stata effettuata presso il Laboratorio di Chimica 
Analitica del Dipartimento di Chimica, diretto dal Prof. L. Campanella.
  
 
 
 
 
 
 
 
 
P a r t e   
G e n e r a l e 
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CAPITOLO 1 – ROS: ASPETTI GENERALI 
1.1 -  STRESS OSSIDATIVO  
Negli ultimi anni è cresciuto enormemente l’interesse riguardo agli aspetti 
tossicologici dello stress ossidativo e sono aumentate considerevolmente le 
ricerche scientifiche sui meccanismi di tale fenomeno e sulle risposte cellulari 
in vari sistemi biologici. 
Le conseguenze tossiche dello stress ossidativo a livello sub-cellulare 
includono la perossidazione lipidica e danni ossidativi a macromolecole come 
DNA e proteine. 
La scoperta della superossido dismutasi ad opera di McCord e Fridovich  ha 
fornito la prima importante evidenza dell’azione dei radicali liberi e dello 
stress ossidativo sulle membrane biologiche [9]. 
Lo stress ossidativo non è altro che quella condizione fisiologica che si 
verifica a livello cellulare a causa di uno squilibrio tra i meccanismi di 
produzione dei radicali liberi e i meccanismi di rimozione. La maggioranza di 
queste specie radicaliche coinvolge l’ossigeno e sono definite con il termine 
ROS (Reactive Oxygen Species) [10]. 
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1.2 -  FONTI DI STRESS 
Diversi processi del metabolismo cellulare portano alla formazione di specie 
reattive di ossigeno (ROS) all’interno della cellula. 
Innanzitutto la respirazione cellulare implica la riduzione dell’ossigeno 
molecolare (O2) ad acqua (H2O) attraverso una catena a trasporto elettronico 
a livello mitocondriale.  
Queste reazioni portano alla formazione di intermedi parzialmenti ridotti, 
estremamente reattivi e quindi potenzialmente dannosi, come l’anione 
radicalico superossido (· O2- ), il perossido di idrogeno (H2O2) e il radicale 
idrossilico (HO· ), come illustrato dalle seguenti reazioni: 
(1.1)  O2 + e-    →   · O2-       
      
(1.2)  · O2- + e-  + 2H+   →   H2O2    
     
 
(1.3)  H2O2 + e- + H+  →   HO·  + H2O   
                                
(1.4)  HO·  + e- + H+   →   H2O    
 
Inoltre, a livello cellulare esistono diversi enzimi ad azione ossidante che 
producono ROS. La diammina ossidasi, il triptofano diossigenasi, la xantina 
ossidasi ed il citocromo P-450-reduttasi possono generare l’anione radicalico 
superossido (· O2-), mentre enzimi come la guanil-ciclasi e la glucosio-ossidasi 
generano H2O2 [11-12].  
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In maniera simile, l’ossido nitrico sintetasi produce l’anione radicalico 
superossido (· O2-) in condizioni di carenza di arginina [13]. 
Altri processi enzimatici producono a livello extracellulare l’anione radicalico 
superossido: basti pensare all’attività dei leucotrieni, che generano 
lipossigenasi [14] ed all’attività delle prostaglandine che generano 
ciclossigenasi [15]. 
In ultimo, gli xenobiotici rappresentano la terza fonte di ROS, in quanto 
possono stimolare la produzione di radicali dell’ossigeno all’interno della 
cellula secondo diversi meccanismi: ad esempio possono indurre gli stessi 
sistemi enzimatici visti in precedenza [16]; possono inibire la catena 
respiratoria a trasporto elettronico con conseguente accumulo di specie 
reattive [17] o possono inattivare gli enzimi ad azione antiossidante [18]. 
1.3 – ATTIVITÀ DEI ROS 
Una volta prodotti, i ROS possono danneggiare i componenti cellulari ed i 
tessuti. A riguardo, l’anione superossido (· O2-) e il radicale idrossilico (HO.) 
sono tra le specie più studiate. 
La tossicità dell’anione radicalico superossido (·O2-) viene spiegata 
considerando la reazione con il perossido d’idrogeno che porta alla 
formazione di specie ancor più reattive. 
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Il radicale idrossilico che si forma è uno tra i più potenti ossidanti presente a 
livello biologico e reagisce indiscriminatamente con i componenti cellulari, 
come i lipidi, il DNA e le proteine.   
HO.  può essere prodotto dalla reazione di  · O2- e H2O2  secondo il processo 
di Haber-Weiss [19]: 
(1.5)  2 · O2-+ 2H+  →  H2O2  + O2     
        
(1.6)  · O2- + H2O2    →   HO·  + OH- + O2   
     
 
Poiché la cinetica di reazione è estremamente lenta [20], alcuni metalli di 
transizione, come il ferro o il rame, agiscono da catalizzatori: 
(1.7)  · O2-  + Fe3+  →  O2  +  Fe2+     
      
(1.8)             Fe2+  +  H2O2    →   HO·   + OH- + Fe3+  
 
La natura polianionica delle membrane cellulari e del DNA forniscono una 
struttura adeguata all’aderenza dei cationi metallici. In questo modo, l’anione 
idrossilico prodotto si troverebbe direttamente a contatto con i bersagli 
biologici, determinando di conseguenza l’ossidazione dei lipidi, delle proteine 
e del DNA [21-23]. 
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1.4 – PEROSSIDAZIONE LIPIDICA 
Gli acidi grassi polinsaturi (PUFAs4) rappresentano dei substrati eccellenti per 
la perossidazione lipidica, a causa della presenza dei gruppi reattivi bis-allilici 
metilenici. 
I legami C-H di queste unità metileniche reattive sono caratterizzati da una 
bassa energia di dissociazione, che rende gli atomi di idrogeni più facilmente 
estraibili nelle reazioni con specie radicaliche [24]. Ovviamente la suscettibilità 
di un particolare PUFA verso la perossidazione aumenta all’aumentare del 
numero dei siti insaturi presenti nella catena lipidica [25]. 
Il processo di auto-ossidazione dei lipidi nei sistemi biologici procede 
attraverso una reazione a catena che consiste di 3 fasi principali: inizio, 
propagazione e terminazione. 
La fase di inizio può derivare dalla reazione di una specie reattiva, come 
l’ossigeno singoletto (1O2), l’anione radicale superossido (·O2-) o il radicale 
idrossilico (HO· ), con un substrato lipidico. Questo determina l’estrazione di 
un atomo di idrogeno dal carbonio metilenico del substrato lipidico (LH), 
generando un radicale altamente reattivo (L· ). 
Nella fase di propagazione della perossidazione lipidica, l’ossigeno molecolare 
si addiziona rapidamente al radicale lipidico prodotto formando il perossi-
radicale lipidico (LOO.), che a sua volta può estrarre un atomo d’idrogeno da 
                                                          
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 PUFAs: PolyUnsaturated Fatty Acids 
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numerose macromolecole biologiche, quali proteine e DNA; si genera in 
questo modo l’idroperossido lipidico (LOOH).  
Alternativamente, una molecola antiossidante qual è l’ α-tocoferolo (α-TOH) 
può agire da donatore di atomi di idrogeno, generando LOOH e il fenossi-
radicale dell’ α-tocoferolo inerte (α-TO.).  
In assenza di antiossidanti o altri inibitori, LOO. può estrarre un atomo di 
idrogeno da un’altra molecola lipidica (LH), producendo un altro radicale (L· ) 
altamente reattivo, propagando così la reazione a catena. 
In figura 1.1 viene mostrato schematicamente il processo di perossidazione 
lipidica. 
 
    
  
 
 
 
 
 
 
 
Figura 1. 1 - Schema della perossidazione lipidica