Deposizione via plasma di film sottili con proprietà acido-base variabili

proprietà acido-base del film. I risultati delle analisi di angolo di contatto sono stati 
confrontati con quelli ottenuti da caratterizzazioni XPS (X-rays Photoelectron 
Spectroscopy) e FT-IR (Fourier Transform Infra-Red spectroscopy) che hanno uno 
spessore di campionamento maggiore. Con questi due metodi di analisi sono stati 
identificati e quantificati i gruppi funzionali presenti sulla superficie del film così da 
poter correlare le proprietà acido-base del film alla presenza o all’assenza di 
determinate funzionalità superficiali. 
Si pensa che questo approccio possa fornire un importante contributo nel definire 
il tipo di interazioni all’interfaccia tra i coating depositati via plasma e il liquido in 
determinate condizioni di pH, associandole alla presenza o meno di dati gruppi 
funzionali superficiali. Si ricorda, infatti, che la superficie di un materiale gioca un 
ruolo fondamentale nel modulare alcune risposte in vitro ed in vivo con i fluidi 
biologici. Difatti, la realizzazione di una superficie che abbia opportune 
caratteristiche chimico-fisiche è un aspetto di notevole importanza nello studio ed 
ingegnerizzazione di materiali idonei per scopi biomedici.  Impiego diretto di questi 
studi poterebbe essere non solo nel campo dei biomateriali, cioè nel migliorare la 
biocompatibilità, ma anche in campo farmaceutico nel rilascio controllato dei 
farmaci, e nel campo dei biosensori. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 5
CAPITOLO 1
 
 
 
INTRODUZIONE 
 
1.1 IL RUOLO DELLE SUPERFICI E DELLE TECNICHE DI 
MODIFICAZIONE SUPERFICIALE IN CAMPO BIOMEDICO 
 
Il termine biomateriale definisce i materiali artificiali (polimeri, metalli, ceramici, 
compositi, etc.) impiegati in biologia e medicina nella realizzazione di protesi, 
dispositivi, sensori e articoli monouso in plastica (capsule di petri da laboratorio, 
cateteri, tubazioni, etc.) destinati a svolgere una funzione pre-definita in contatto 
con fluidi, tessuti e molecole di tipo biologico in vitro, ex vivo e in vivo [1]. Dato che 
la risposta del sistema biologico al materiale è mediata da interazioni tra esso e la 
superficie del materiale stesso, il ruolo svolto dalle superfici in campo biologico e 
medico è fondamentale. 
Impianti biomedici come valvole cardiache, protesi vascolari, impianti mammari e 
lenti intraoculari entrano in contatto tramite la propria superficie con l’ambiente 
biologico circostante, per cui la risposta di quest’ultimo è fortemente influenzata  
dalla natura chimica e morfologica della superficie del corpo estraneo [2]. Le 
superfici dei materiali in contatto con fluidi e tessuti biologici adsorbono e 
desorbono dinamicamente, fino a pochi secondi dopo il contatto, uno strato di 
proteine la cui distribuzione e conformazione dipende dall’interfaccia 
materiale/fluido o materiale/tessuto, quindi, dalle proprietà superficiali 
(composizione chimica, energia superficiale, carica elettrostatica, etc.) del 
materiale. Lo strato proteico adsorbito media, successivamente e in maniera 
dinamica, adesione ed eventualmente crescita e funzionamento delle cellule del 
sistema biologico, e la loro integrazione con il materiale [3,4,5].  Il comportamento 
delle cellule sui materiali artificiali è, inoltre, influenzato dalla morfologia delle 
superfici (rugosità, domini a composizione chimica diversa, topografia), anche su 
scala nanometrica [6,7]. Questa complessa problematica è alla base di tutti gli 
 6
approcci tecnologici volti a modificare le superfici dei materiali per guidarne le 
interazioni con i sistemi biologici in vitro, ex vitro e in vivo. In molte applicazioni 
biomediche (kit per diagnostica, coltura cellulare, bio-integrazione di protesi, etc.) 
occorre stimolare adesione e crescita cellulare su materiali convenzionali che, 
altrimenti, non la sosterrebbero in modo conveniente. Molti dei polimeri 
comunemente applicati in campo biomedico, come le poliolefine, il polivinilcloruro, 
il silicone, ecc., non sono idonei a supportare la crescita e l’adesione di cellule; 
l’innesto di gruppi chimici polari sulla superficie di uno di questi polimeri, per 
esempio, o la deposizione di film caratterizzati dalla presenza di gruppi polari, 
permette di aumentarne il carattere idrofilo, quindi, la capacità, ad esso correlata, 
di sostenere adesione e crescita di cellule. Di conseguenza, qualora si voglia 
applicare tali polimeri nell’ambito della rigenerazione dei tessuti e nell’integrazione 
dei materiali con gli stessi, è necessario modificare la superficie dei materiali con 
processi mirati ad ottimizzare la loro interazione con i sistemi biologici, 
migliorandone la biocompatibilità. 
Nell’ambito della ingegnerizzazione di materiali biocompatibili è necessario 
considerare che, per alcune applicazioni, occorre modificare solo le proprietà 
superficiali dei materiali, lasciando inalterate quelle di bulk. 
In questa ottica la modificazione della chimica superficiale dei materiali con metodi 
chimici è considerata una delle strategie comunemente applicate per migliorare 
l’interfaccia materiale/ambiente biologico. 
Il PS, ad esempio, opportunamente modificato per trattamenti corona con gruppi 
ossigenati o azotati, è comunemente utilizzato come supporto per l’adesione 
cellulare e per questo motivo è denominato cell culture polystyrene, PScc [8]. 
Fino ad oggi, però, non si è capito fino in fondo quali funzionalità chimiche siano 
realmente coinvolte nelle interazioni con i fluidi e tessuti biologici, responsabili del 
miglioramento delle performance dei materiali; le risposte, infatti, variano al variare 
del tipo di cellula investigata e dell’ambiente circostante il materiale stesso. In 
generale, i risultati migliori sono stati ottenuti con gruppi solfato [9], carbossilici 
[10,11],  idrossilici [12] ed amminici [13]. La presenza di gruppi chimici polari sulla 
superficie di un polimero idrofobo permette, comunque, di aumentare il carattere 
idrofilo, quindi, la capacità, ad esso correlata, di sostenere l’adesione e la crescita 
delle cellule [14, 15]. Nel funzionalizzare le superfici è anche possibile generare 
film a densità di gruppi funzionali e a carattere idrofilo e acido/base controllati.  
 7
Le superfici funzionalizzate via plasma, o per altro metodo, possono essere 
ulteriormente modificate per immobilizzazione covalente di biomolecole (peptidi 
[16], carboidrati [17], molecole anti-trombogeniche [18], enzimi [19], molecole 
antibatteriche [20], anticorpi,etc.), che offrono interazioni specifiche con le cellule e 
i fluidi biologici.  
E’, quindi, facile capire perché gli studiosi che si occupano di materiali biomedici 
spesso focalizzino l’attenzione sulle modificazioni superficiali, in quanto da queste 
dipendono  la maggior parte delle risposte biologiche  che si realizzano 
all’interfaccia. 
Le modificazioni superficiali possono essere applicate per la realizzazione di 
materiali polimerici intelligenti (smart materials), capaci di rispondere con un 
considerevole cambiamento delle proprie proprietà chimico-fisiche a stimoli     
dell’ambiente circostante in cui sono posti: temperatura, pH, fattori chimici, luce, 
etc. I materiali intelligenti, sensibili agli stimoli, possono essere impiegati per 
risolvere problemi biologici come bio-separazione, rilascio controllato di farmaci, 
progettazione di biosensori, ingegneria tissutale. Lo scopo di questi materiali è 
mimare il più possibile la complessità dei sistemi biologici, in cui ogni risposta 
nasce da uno stimolo [21]. Un esempio di smart material si ha nell’ambito del 
rilascio controllato dei farmaci: sono stati studiati  Hydrogel (gel colloidali in cui 
l’acqua è il mezzo  di dispersione) capaci di rispondere a variazioni di pH [22];  
questi materiali contengono, in genere, alcuni gruppi ionizzabili come acidi 
carbossilici o gruppi amminici. I polimeri ionici più comunemente studiati includono 
poliacrilammide (PAAm), poliacidoacrilico (PAA), poliacidometacrilico (PMAA), 
polidietilamminoetilmetacrilato (PDEAEMA) e polidimetilamminoetilmetacrilato 
(PDMAEMA). Nei mezzi acquosi di appropriato pH e forza ionica, i gruppi 
funzionali alla superficie del materiale possono ionizzarsi dando luogo a dei 
processi estremamente utili in campo biomedico [22]. I polimeri sensibili al pH, a 
causa della loro capacità di swelling (rigonfiamento) proporzionale alle variazioni di 
pH, qualora  “caricati” con un farmaco possono consentire un rilascio graduale 
dello stesso in funzione del pH dell’ ambiente in cui si trovano. In questa maniera 
si può fare in modo che il fermaco venga rilasciato, per esempio, o nello stomaco 
(pH acido) o nell’intestino (pH basico) [23], a seconda delle caratteristiche acido-
base dell’hydrogel. 
 8
Per tutti i motivi sopra riportati, la funzionalizzazione chimica dei materiali in 
superficie gioca un ruolo importante nelle interazioni all’interfaccia 
materiale/ambiente biologico dato che può incrementare significativamente 
l’adesione a superfici inorganiche, l’adsorbimento su fibre, la solubilità in liquidi 
inorganici e il mescolamento con altri polimeri [24]. Nel caso in cui si abbia a che 
fare con film acido/base, è importante determinare l’acidità o la basicità dei gruppi 
funzionali presenti sulla superficie dei materiali per razionalizzare e controllare le 
proprietà dei materiali, come bagnabilità, adesione ed energia libera superficiale, e 
per definire le proprietà chimico-fisiche e il carattere dell’interfase [25]. 
Tra le tecnologie più evolute impiegate  per modificare la superficie dei materiali, i 
processi di modificazione superficiale via plasma (deposizione di film sottili, dry-
etching e trattamenti) hanno raggiunto oggi una grande diffusione in diversi settori 
scientifici e tecnologici, incluso quello dei biomateriali. I processi plasmo-chimici 
offrono numerosi vantaggi rispetto ad altre tecniche di modificazione superficiale , 
in quanto : 
- non modificano il bulk del substrato, ma solo la superficie; 
- permettono di ottenere film e superfici a composizione variabile programmata; 
- sono facilmente controllabili, variando, ad esempio, il gas di alimentazione del      
plasma o modificando opportunamente le condizioni sperimentali (potenza, 
pressione, etc.); 
- sono notevolmente riproducibili ; 
- possono modificare substrati di varie forme in maniera sterile; 
- sono a basso impatto ambientale, perché sono tecniche “a secco”, che non 
usano solventi. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 9
La Tabella 1.1, sotto riportata, elenca le principali applicazioni dei processi via 
plasma in campo biomedico. 
 
PE-CVD  
 - coating cell-adhesive 
 - coating cell-repulsive 
 - coating resistenti alla colonizzazione batterica 
 - coating fuzionalizzati per immobilizzazione di biomolecole o per  
drug delivery 
 - coating idrofobi/idrofili 
 - coating protettivi 
 - micro-patterning di superfici 
Plasma Treatments 
  - sperfici cell-adhesive 
- superfici funzionalizzate per immobilizzazione di biomolecole 
- superfici idrofobe/idrofile 
- micro-patterning di superfici 
Dry Etching 
  - sterilizzazione 
  - produzione di master in quarzo per soft-litography 
  - micro e nano-strutturizzazione di polimeri per dispositivi e 
sensori 
 
Tabella 1.1: processi plasmochimici per applicazioni biomediche. 
 
Nel caso in cui le modificazioni superficiali prevedano la deposizione di film sottili, 
è necessario garantire una buona adesione del film al substrato. In questo lavoro 
di tesi è stata impiegata la tecnica PE-CVD al fine di ottenere film sottili di pochi 
nanometri sulla superficie di PS, per modificare in maniera controllata la chimica e 
le proprietà acido-base del substrato.  
 
 
 
 
 10
1.2 FUNZIONALIZZAZIONE DI SUPERFICI CON GRUPPI 
OSSIGENATI ED  AZOTATI 
 
I processi plasmo-chimici garantiscono un attento controllo nella 
funzionalizzazione delle superfici, non alterano le proprietà massive del materiale 
e garantiscono un basso impatto ambientale essendo tecnologie “a secco” e 
senza uso di solventi. Nei paragrafi seguenti sono descritti alcuni dei processi 
generalmente utilizzati per l’innesto via plasma di gruppi funzionali alle superfici, 
focalizzando maggiore attenzione alla trattazione di superfici contenenti gruppi 
ossigenati ed azotati. In particolare, saranno descritti i processi di deposizione da 
vapori di acido acrilico e/o allilammina per generare superfici a densità di gruppi 
funzionali, carattere idrofilo e acido/base controllati. 
 
 
1.2.1 PE-CVD DI GRUPPI OSSIGENATI: DEPOSIZIONE DI FILM DA VAPORI DI 
AA 
 
 
La deposizione via plasma di film contenenti gruppi ossigenati contribuisce a 
rendere le superfici  dei materiali adatte alla coltura cellulare, sebbene la relazione 
tra la distribuzione e la densità delle funzioni ossigenate e l’affinità superficiale per 
le cellule non è ancora molto chiara. Sperimentalmente si è visto che è possibile 
funzionalizzare le superfici con gruppi ossigenati attraverso processi PE-CVD, tra 
l’altro, da vapori di alcol allilico [26], acetone, metanolo, acido formico[5], 
idrossimetacrilato(HEMA) [27] e di acido acrilico [28]. In questo lavoro di tesi si è 
impiegato quest’ultimo monomero perché si è visto che la deposizione di film 
pdAA (plasma deposited acrylic acid) consente di ottenere, in particolari condizioni 
sperimentali, film stabili in ambiente acquoso, a densità controllata di gruppi 
carbossilici, buoni per controllare direttamente la crescita cellulare, e anche come 
substrato per l’immobilizzazione di biomolecole [29]. Recenti lavori sperimentali 
mostrano che le funzionalità carbossiliche rivestono un ruolo fondamentale nel 
promuovere l’adesione aspecifica di linee cellulari [30]. E’ stato, infatti, dimostrato 
che i gruppi carichi negativamente, come -COO
-
, sono particolarmente indicati per 
questa funzione [31]. Tra le linee cellulari testate in questo laboratorio vi sono i 
 11
fibroblasti [32] e cheratinociti [7], che mostrano una morfologia distesa su superfici 
ricche di gruppi carbossilici. Inoltre, recenti ricerche hanno dimostrato che 
potrebbe esistere una densità superficiale ottimale di gruppi carbossilici, al di 
sopra e al di sotto del quale la proliferazione cellulare diminuisce.   
Oltre a stimolare l’adesione cellulare in maniera aspecifica, si possono impiegare 
superfici con funzionalità carbossiliche per l’immobilizzazione covalente di 
molecole, tra cui peptidi, oligonucleotidi come l’RGD (costituita dalla sequenza 
degli amminoacidi Arg-Gly-Asp), zuccheri, enzimi, etc. [16]. 
Recenti studi hanno mostrato che minore è il contenuto di gruppi carbossilici nel 
coating maggiore è la stabilità del film in acqua, poiché esso risulta più reticolato, 
più stabile e non soggetto a rilascio di frammenti polari [33]. Quest’ultimo aspetto è 
particolarmente importante per realizzare superfici impiegate in colture cellulari 
visto che in tali esperimenti il materiale è a contatto con fluidi biologici acquosi. Per 
garantire una maggiore ritenzione della struttura del monomero, quindi, una 
maggiore percentuale di funzionalità carbossiliche del film, quando questo serve, è 
necessario lavorare in condizioni di bassa frammentazione delle molecole del 
precursore nella fase plasma (es. AA) come: bassa potenza, basso flusso del 
monomero, plasma modulato. Per ottenere film più stabili, anche se con una 
densità minore di gruppi carbossilici, occorre lavorare in condizioni di maggiore 
frammentazione. 
Sperimentalmente è stato dimostrato  che un aumento della potenza comporta 
una maggiore frammentazione del monomero dato che c’è un maggiore campo 
elettrico e, quindi, una maggior probabilità in fase plasma di urti di tipo anelastico; 
come verificato con analisi di superficie (XPS) e della fase plasma (Mass 
Spectroscopy/Optical Emission Spectroscopy) la densità dei gruppi          –COOH  
nei film diminuisce all’aumentare dei frammenti del monomero, come CO e CH, in 
fase plasma, la cui presenza può essere considerata come indicatore della 
frammentazione [2]. Lavori precedenti effettuati in questo laboratorio hanno però 
dimostrato mediante AOES (Actinometric Optical Emission Spectroscopy) della 
fase plasma che la specie CO presenta un massimo di concentrazione relativa a 
bassa potenza, tendendo poi, a più alte potenze, ad una lenta diminuzione  fino al 
raggiungimento di un platau. La specie H, che deriva dalla frammentazione del 
monomero, ma anche dei suoi frammenti, come le specie OH e CH, aumenta 
nettamente fino ad alte potenze, restando quasi costante a potenze superiori. 
 12
Questi risultati, quindi, fanno supporre che a bassa potenza la specie CO può 
considerarsi come indicatore della frammentazione del monomero AA [2]. La 
specie H, che proviene anche da altri frammenti, non può essere considerata 
un’indicatore sicuro della frammentazione. 
Anche analisi FT-IR di film pdAA (plasma deposited Acrylic Acid) ottenuti a diverse 
potenze hanno confermato la tesi della maggiore reticolazione del film ad elevate 
potenze: all’aumentare della potenza applicata il segnale di stretching del gruppo 
–C=O, indice della presenza dei gruppi –COOH, tende a diminuire d’intensità 
rispetto ai segnali di stretching e bending dei gruppi –C-H [2]. Inoltre, come misura 
della ritenzione della struttura del monomero è stato definito il rapporto dell’area 
relativa al segnale del gruppo –C=O rispetto a quella relativa del segnale di 
stretching dei gruppi alifatici –C-H ( tra 2980-2870 cm
-1
). Questo rapporto è 
elevato a basse potenze, indicando, quindi, un’ elevata quantità di gruppi –COOH 
in questa condizione. All’ aumentare della potenza applicata, invece, il rapporto 
diminuisce fino a diventare costante, ad indicare che alla condizione di elevata 
frammentazione del monomero in fase plasma corrisponde una diminuzione dei 
gruppi carbossilici sulla superficie del coating, e una maggiore reticolazione del 
film [29, 34]. 
Sulla superficie, misure di angolo di contatto hanno mostrato che il carattere 
idrofilo dei film decresce all’aumentare della potenza, a conseguenza, tra l’altro, 
della perdita di gruppi -COOH nella struttura. I differenti approcci di Owens e 
Wendt, Fowkes e Mostafa e van Oss et al. sono stati considerati nel determinare 
la tensione superficiale totale valutando i diversi contributi polare, dispersivo, 
legame idrogeno e interazioni acido-base: si è dedotto che il legame idrogeno  e il 
carattere acido-base diminuiscono all’aumentare della potenza, mentre il 
contributo dispersivo dell’energia libera superficiale rimane pressoché costante. Si 
dimostra, così, che sono le interazioni polari tra la superficie e la soluzione, 
dovute, in funzione della potenza impiegata, alla presenza o assenza di 
determinate funzionalità, che influenzano il lavoro di adesione totale all’interfaccia 
superficie/soluzione [29, 35 ]. 
Sono stati inoltre effettuati esperimenti per correlare l’acidità superficiale del film 
con la densità di gruppi acidi introdotti; a riguardo vi sono gli studi di T. B. Lloyd e 
J. A. Coleman che hanno testato l’acidità superficiale del substrato, rappresentato 
dal copolimero ottenuto via plasma da etilene (EAC) a percentuali variabili di AA, 
 13
fino al 20%. Essi hanno effettuato una titolazione mediante angolo di contatto: 
all’aumentare della percentuale di AA introdotta nella scarica il salto al punto di 
flesso della curva di titolazione diminuisce in altezza, indicando una diminuzione 
del grado di ionizzabilità dei gruppi carbossilici presenti sul film; il tutto è dovuto, 
probabilmente, ad un aumento di legami idrogeno intramolecolari sulla superficie 
per l’aumento della concentrazione delle funzionalità carbossiliche [36]. 
 
 
1.2.2  PE-CVD DI GRUPPI AZOTATI : DEPOSIZIONE DI FILM DA VAPORI DI 
AAm 
 
 
La funzionalizzazione via plasma con gruppi amminici di diverse superfici 
polimeriche, oltre che mediante grafting di gruppi funzionali, può essere realizzata 
mediante la deposizione via plasma di monomeri organici contenti tali gruppi. 
L’uso di monomeri insaturi come l’allilammina è vantaggioso a confronto con quelli 
saturi, come la propargilammina, poiché è necessaria una minore quantità di 
energia per attivare le molecole, quindi la deposizione, e, come conseguenza, si 
può avere ritenzione di funzionalità amminiche in alta densità [37]. Gancarz et al. 
[38] hanno paragonato la deposizione di film da vapori di allilammina con quelli 
della n-butilammina; i risultati XPS hanno mostrato come il rapporto N/C sia 
nettamente superiore con l’allilammina (0.27), contro 0.07, a parità di condizioni 
sperimentali. Inoltre, usando l’allilammina, dalla deconvoluzione del picco C1s, la 
percentuale della componente amminica           (-CH
2
 -NH
2
) risulta fino a tre volte 
superiore rispetto all’ n-butilammina.  
Analisi FT-IR di coating di AAm ottenuti a diverse potenze hanno mostrato,      
all’aumentare della potenza, l’aumento dello stretching del -C≡N, indice di elevata 
frammentazione del monomero in fase plasma e di una conseguente elevata 
reticolazione del film. E’ stata, quindi, ipotizzata a potenze elevate la conversione 
delle ammine primarie (-NH
2
) presenti nel monomero ad immine     (-CH=NH) e 
nitrili (C≡N); inoltre, l’aumento della potenza nel plasma sembra far aumentare nel 
coating la densità del gruppo nitrile (C≡N)  in relazione a quello imminico (-
CH=NH) [39,40, 41]. 
 14