Ruolo di ponti salini e residui idrofobici nel riconoscimento molecolare di proteine anticongelamento di tipo III

I RIASSUNTO Gli organismi adattati al freddo, detti psicrofili, riescono a sopravvivere in ambienti in cui le temperature sono molto basse e le condizioni di vita sono restrittive. A queste temperature inaccessibili, i flussi metabolici sono compromessi e di conseguenza questi organismi hanno sviluppato diverse strategie di adattamento per poter sopravvivere. Alcuni batteri, piante e vertebrati tra cui i pesci che vivono in ambienti molto freddi prevengono danni cellulari e a livello dei tessuti producendo proteine anticongelamento (AFP). Queste proteine sono in grado di legarsi ai cristalli di ghiaccio, inibire la loro crescita e impedirne la ricristallizzazione che potrebbe risultare fatale per l’organismo. Le proteine anticongelamento che sono state ritrovate in pesci come Macrozoarces americanus, permettono la diminuzione del punto di congelamento del sangue e dei fluidi corporei (a -2.5° C) al di sotto del punto di congelamento dell’acqua marina (-1.9° C). I pesci che abitano le acque alle alte latitudini sono quindi protetti dal congelamento non solo da meccanismi colligativi (come presenza di soluti nell’acqua) ma anche da meccanismi non colligativi causati dal legame delle proteine anticongelamento alla superficie del ghiaccio. Nel sangue dell’organismo Macrozoarces americanus sono state ritrovate in alte concentrazioni le proteine anticongelamento di tipo III. Queste proteine AFP di tipo III presentano un fold globulare e una struttura compatta, il cui ripiegamento mostra numerosi β strand corti e imperfetti ed un giro di α elica. Le proteine anticongelamento di classe III sono oggetto di interesse per la loro capacità di legarsi al ghiaccio; esse presentano una superficie di legame relativamente piatta, centrata sul residuo alanina 16, che comprende alcuni residui idrofilici Gln 9, Thr 15, Thr 18, Glu 44 e Asn 14. Inizialmente si era ipotizzato che il legame al ghiaccio avvenisse attraverso un network di legami idrogeno tra questi residui idrofilici presenti sulla superficie delle proteine anticongelamento e un piano del ghiaccio chiamato prism plane. Studi successivi hanno dimostrato che il legame tra proteina anticongelamento e ghiaccio non coinvolge solo il prism plane ma anche un altro piano del ghiaccio; questo ha suggerito che anche altri residui della proteina potrebbero essere coinvolti nel legame. I residui potenzialmente coinvolti nel legame al ghiaccio sono i residui idrofobici collocati sulla superficie della proteina vicino ai residui idrofilici centrali, che interagiscono con il ghiaccio attraverso interazioni di Van der Waals permettendo un alta complementarietà tra le due superfici. Nel contesto del primo lavoro l’obiettivo degli autori è stata la determinazione degli effetti nell’attività anticongelamento della proteina a seguito di mutazioni nei residui idrofobici Leu 19, Val 20, Ile 13, Val 41. Per valutare il ruolo di questi residui, essi sono stati mutati in amminoacidi idrofobici più piccoli (come alanina) attraverso esperimenti di mutagenesi e sono state monitorate le variazioni in attività anticongelamento. Una riduzione nella catena laterale di questi amminoacidi impedisce o minimizza la formazione di interazioni di Van der Waals con il ghiaccio causando una forte perdita di attività anticongelamento e confermando l’importanza di questi residui idrofobici. Nel secondo studio, invece, sono state effettuate analisi termodinamiche quantitative per determinare la stabilità conformazionale delle AFP III dall’organismo Macrozoarces americanus seguite da studi di denaturazione termica e chimica; gli autori hanno inoltre concentrato la loro attenzione sul ruolo dei ponti salini presenti nelle proteine AFP di tipo III. Le proteine anticongelamento di tipo III essendo proteine psicrofile, presentano una bassa stabilità termodinamica e hanno rivelato inoltre un’alta suscettibilità alla denaturazione sia termica che chimica e un processo di unfolding completamente reversibile. La curva di stabilità di queste proteine, ricavata dai dati ottenuti in studi di denaturazione termica e chimica, ha evidenziato un massimo di stabilità intorno a 0°C, entro il ristretto range di temperatura in cui queste proteine devono esercitare la loro funzione anticongelamento. Le proteine anticongelamento di tipo III da Macrozoarces americanus sono caratterizzate dalla presenza di 3 ponti salini e 2 interazioni elettrostatiche a medio raggio che potrebbero contribuire alla stabilità della proteina. La lieve diminuzione di stabilità di AFP III a seguito di un innalzamento della forza