Ruolo di ponti salini e residui idrofobici nel riconoscimento molecolare di proteine anticongelamento di tipo III

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RIASSUNTO 
 
Gli organismi adattati al freddo, detti psicrofili, riescono a sopravvivere in ambienti in cui le 
temperature sono molto basse e le condizioni di vita sono restrittive. A queste temperature 
inaccessibili, i flussi metabolici sono compromessi e di conseguenza questi organismi hanno 
sviluppato diverse strategie di adattamento per poter sopravvivere.  
Alcuni batteri, piante e vertebrati tra cui i pesci che vivono in ambienti molto freddi 
prevengono danni cellulari e a livello dei tessuti producendo proteine anticongelamento (AFP). 
Queste proteine sono in grado di legarsi ai cristalli di ghiaccio, inibire la loro crescita e 
impedirne la ricristallizzazione che potrebbe risultare fatale per l’organismo. Le proteine 
anticongelamento che sono state ritrovate in pesci come Macrozoarces americanus, permettono la 
diminuzione del punto di congelamento del sangue e dei fluidi corporei (a -2.5° C) al di sotto del 
punto di congelamento dell’acqua marina (-1.9° C). I pesci che abitano le acque alle alte 
latitudini sono quindi protetti dal congelamento non solo da meccanismi colligativi (come 
presenza di soluti nell’acqua) ma anche da meccanismi non colligativi causati dal legame delle 
proteine anticongelamento alla superficie del ghiaccio. Nel sangue dell’organismo Macrozoarces 
americanus sono state ritrovate in alte concentrazioni le proteine anticongelamento di tipo III. 
Queste proteine AFP di tipo III presentano un fold globulare e una struttura compatta, il cui 
ripiegamento mostra numerosi β strand corti e imperfetti ed un giro di α elica. Le proteine 
anticongelamento di classe III sono oggetto di interesse per la loro capacità di legarsi al 
ghiaccio; esse presentano una superficie di legame relativamente piatta, centrata sul residuo 
alanina 16, che comprende alcuni residui idrofilici Gln 9, Thr 15, Thr 18, Glu 44 e Asn 14. 
Inizialmente si era ipotizzato che il legame al ghiaccio avvenisse attraverso un network di 
legami idrogeno tra questi residui idrofilici presenti sulla superficie delle proteine 
anticongelamento e un piano del ghiaccio chiamato prism plane. Studi successivi hanno 
dimostrato che il legame tra proteina anticongelamento e ghiaccio non coinvolge solo il prism 
plane ma anche un altro piano del ghiaccio; questo ha suggerito che anche altri residui della 
proteina potrebbero essere coinvolti nel legame. I residui potenzialmente coinvolti nel legame  
al ghiaccio sono i residui idrofobici collocati sulla superficie della proteina vicino ai residui 
idrofilici centrali, che interagiscono con il ghiaccio attraverso interazioni di Van der Waals 
permettendo un alta complementarietà tra le due superfici. 
Nel contesto del primo lavoro l’obiettivo degli autori è stata la determinazione degli effetti 
nell’attività anticongelamento della proteina a seguito di mutazioni nei residui idrofobici Leu 
19, Val 20, Ile 13, Val 41. Per valutare il ruolo di questi residui, essi sono stati mutati in 
amminoacidi idrofobici più piccoli (come alanina) attraverso esperimenti di mutagenesi e sono 
state monitorate le variazioni in attività anticongelamento. Una riduzione nella catena laterale 
di questi amminoacidi impedisce o minimizza la formazione di interazioni di Van der Waals con 
il ghiaccio causando una forte perdita di attività anticongelamento e confermando l’importanza 
di questi residui idrofobici.  
Nel secondo studio, invece, sono state effettuate analisi termodinamiche quantitative per 
determinare la stabilità conformazionale delle AFP III dall’organismo Macrozoarces americanus  
seguite da studi di denaturazione termica e chimica; gli autori hanno inoltre concentrato la loro 
attenzione sul ruolo dei ponti salini presenti nelle proteine AFP di tipo III. Le proteine 
anticongelamento di tipo III essendo proteine psicrofile, presentano una bassa stabilità 
termodinamica e hanno rivelato inoltre un’alta suscettibilità alla denaturazione sia termica che 
chimica e un processo di unfolding completamente reversibile. La curva di stabilità di queste 
proteine, ricavata dai dati ottenuti in studi di denaturazione termica e chimica, ha evidenziato 
un massimo di stabilità intorno a 0°C, entro il ristretto range di temperatura in cui queste 
proteine devono esercitare la loro funzione anticongelamento. Le proteine anticongelamento di 
tipo III da Macrozoarces americanus sono caratterizzate dalla presenza di 3 ponti salini e 2 
interazioni elettrostatiche a medio raggio che potrebbero contribuire alla stabilità della 
proteina. La lieve diminuzione di stabilità di AFP III a seguito di un innalzamento della forza
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ionica o un abbassamento del pH, hanno suggerito che il globale contributo delle interazioni 
elettrostatiche è molto ridotto. Questo potrebbe significare che le forze intramolecolari in 
proteine psicrofile come le proteine anticongelamento di tipo III contribuiscono in modo 
trascurabile o nullo alla stabilità strutturale della proteina. Per verificare questa ipotesi sono 
stati valutati i contributi energetici delle interazioni ioniche presenti, analizzando gli effetti dei 
singoli ponti salini Arg23-Glu25, Arg47/Asp 58 e Arg39/Asp36 con ciclo di doppi mutanti. 
Queste analisi hanno mostrato che due ponti salini esposti al solvente Arg23-Glu25 e Arg47-
Asp58 contribuiscono poco alla stabilità della proteina mentre il ponte salino Asp36-Arg39 ha 
un contributo significativamente diverso. La mutazione del singolo residuo Arg39 in alanina 
destabilizza la proteina mentre la mutazione di Asp36 in alanina la stabilizza; questo indica che 
in queste proteine AFP di tipo III l’Asp36 ha una funzione destabilizzante e la sua rimozione 
porta ad un cambiamento nell’area della catena laterale della Tyr63 (con cui Asp36 formava un 
legame idrogeno che viene prontamente rimosso) che permette un riarrangiamento locale della 
struttura della proteina con conseguente aumento della stabilità. Sommando i risultati dei cicli 
di doppi mutanti, è stato evidenziato il contributo favorevole della carica positiva della catena 
laterale di Arg23, Arg47, Arg39 per la stabilità di AFP III, ma questo contributo non è dato dai 
ponti salini che essi formano con le catene laterali acide di residui limitrofi. Le cariche negative 
dei gruppi carbossilici di Glu25 e Asp58 non contribuiscono alla stabilità di AFP mentre  la 
carica negativa dell’Asp36 ne riduce il valore. Quindi dei tre ponti salini esposti al solvente che 
questi tre residui formano, due non forniscono alcun contributo alla stabilità proteica, mentre 
uno, il ponte salino tra Asp36-Arg39 ha un contributo significativo per la stabilità di AFP III di 
circa 1 kcal/mole e ciò fornisce la prova che, anche nelle proteine psicrofile, è possibile ritrovare 
un network di ponti salini che può contribuire alla stabilità della proteina.
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ABSTRACT 
 
Cold adapted organism, called psychrophiles, are able to survive in environments where 
temperatures are extremely low and living conditions are restrictive. At these inaccessible 
temperatures the metabolic fluxes are compromised and accordingly these organisms have 
developed different adaptation strategies in order to be able to survive.  
Some bacteria, plants and vertebrates, including fish, that live in very cold environments 
prevent cells and tissues damage, producing antifreeze protein (AFP). These proteins are able 
to bind to ice crystals, inhibit their growth and prevent the recrystallization, which could be 
fatal for the organism. The antifreeze proteins, that have been found in fish such as 
Macrozoarces americanus, allow the decrease of the freezing point of blood and body fluids (at -
2.5 ° C) below the freezing point of seawater (-1.9 ° C). Fishes that inhabit the waters at high 
latitudes are thus protected from freezing not only by colligative mechanisms (such as the 
presence of solutes in water) but also by non colligative mechanisms caused by the binding of 
antifreeze proteins to ice. In the blood of Macrozoarces americanus were found high 
concentrations of antifreeze proteins type III. These proteins AFP type III shows a globular 
fold and a compact structure with numerous, short and imperfect β strand and a turn of α helix. 
These antifreeze proteins type III are interesting for their ability to bind ice and they present a 
remarkable flat plane centered on the alanine 16, which includes some hydrophilic residues Gln 
9, Thr 15, Thr 18, Glu 44 Asn 14.  
At the beginning, it was tought that the binding to ice could occur through a network of 
hydrogen bonds between the hydrophilic residues on the surface of the protein and a plane of 
ice called prism plane. Subsequent studies have shown that the binding between antifreeze 
protein and ice not only involves the prism plane but also another plane of ice; this suggests 
that other residues of the protein might be involved in the ice-binding. The residues potentially 
involved in ice-binding are hydrophobic residues located on the surface of the protein near the 
central hydrophilic residues that interact by Van der Waals interactions with ice, allowing an 
high complementarity between the two surfaces.  
In the context of the first work, the authors’ objective was the determination of the effects of 
mutations in hydrophobic residues (Leu 19, Val 20, Ile 15, Val 41) on antifreeze activity. To 
study the role of these residues, they were mutated into smaller hydrophobic amino acids (like 
alanine) through mutagenesis and were monitored changes in antifreeze activity. The size 
reduction in the side chain of these aminoacids prevents or minimizes the formation of Van der 
Waals interactions with ice, causing a significant loss of antifreeze activity confirming the 
importance of hydrophobic residues.  
In the second work,  thermodynamic analysis were carried out to determine the conformational 
stability of AFP III from Macrozoarces americanus followed by thermal and chemical 
denaturation studies; the authors have also focused their attention on the role of salt bridges in 
proteins type III AFP. The type III AFP are psychrophilic proteins: they present a low 
thermodynamic stability, they showed a high susceptibility to thermal and chemical 
denaturation and a completely reversible unfolding process. 
The stability curve of these proteins as a function of temperature, deduced by fitting the values 
obtained in thermal and chemical denaturation studies, reveals a maximum stability around 0 ° 
C, within the very restricted temperature range at which these proteins must exert their 
antifreeze function. Antifreeze proteins type III from Macrozoarces americanus are characterized 
by the presence of 3 salt bridges and 2 medium-range electrostatic interactions that may 
contribute to the stability of the protein. The slight decrease in stability of AFP III following 
an increase in ionic strength or decreasing pH, has suggested that the overall contribution of 
electrostatic interactions is very small. This could mean that the intramolecular forces in 
psychrophilic proteins as AFP type III not significantly contribute in structural stability of the 
protein. To test this hypothesis the contributions of the ionic interaction for stability have been 
verified, analyzing the effects of each salt bridge Arg23-Glu25, Arg47/Asp58 and
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Arg39/Asp36 with double mutant cycle. These analysis show that two solvent exposed salt 
bridges Glu25 and Arg23-Arg47-Asp58 give a very low contribute to the protein stability 
whereas the salt bridge Asp36-Arg39 has a significant contribution. The mutation in alanine of 
single residue Arg39 destabilizes the protein whereas the mutation in alanine of Asp36 
stabilizes it; these results have indicated that in these AFP type III the Asp36 has a 
destabilizing effect and its removal leads to a change in the side chain of Tyr63 (with which 
Asp36 formed an hydrogen bond that is readily removed) that allows a local rearrangement of 
the structure of protein with an increase of stability. Adding the results of double mutant 
cycles, it was highlighted the positive contribution of the positively charged side chain of 
Arg23, Arg47, Arg39 for the stability of AFP III, but this contribution is not mediated by salt 
bridges formation. The negatively charged carboxylates of Glu25 and Asp58 do not contribute 
to the stability of the AFP type III and the negatively charged carboxylate of Asp36 reduces its 
value. The three salt bridges exposed to solvent, two of which do not contribute to stability, 
while the salt bridge between Asp36-Arg39 has a significant contribution to the stability of 
AFP III (about 1 kcal / mole) providing evidences that it is possible to find a network of salt 
bridges that may contribute to the stability of the protein also in psychrophilic proteins. 
 
 
 
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1. INTRODUZIONE 
 
Gli organismi hanno sviluppato strategie sofisticate per adattarsi ad un ambiente variegato e 
variabile pertanto è molto importante analizzare i meccanismi regolativi alla base della 
versatilità fisiologica e metabolica degli organismi con particolare attenzione agli aspetti 
ambientali e biotecnologici. In questo contesto un tema comune a molti progetti di ricerca è 
l’adattamento degli organismi a stress ambientali che comportano cambiamenti globali della 
fisiologia cellulare e dell’espressione genica.  
Gli estremofili sono organismi capaci di colonizzare, con enorme successo, ambienti in cui si 
riscontrano condizioni di vita estreme. Infatti, essi sono in grado di crescere e sopravvivere, 
utilizzando meccanismi specifici di adattamento, in presenza di condizioni estreme di pH 
(acidofili ed alcalofili), di concentrazione salina (alofili), di pressioni idrostatiche (barofili) o di 
temperatura (ipertermofili, termofili e psicrofili).  
 
 
1.1 ORGANISMI ADATTATI AL FREDDO: GLI PSICROFILI  
 
La vita, specialmente quella microbica, si è evoluta affinché fosse in grado di proliferare in una 
grande varietà di ambienti termici differenti. Il primo ostacolo per gli organismi è l'adattamento 
termico che, specialmente alle condizioni estreme, ha limitato la gamma di temperature che 
ogni organismo può tollerare.  
L’evoluzione ha permesso per esempio organismi adattati al freddo, denominati psicrofili, non 
soltanto sopravvivessero in tali ambienti, ma fossero in grado di riprodursi e di svilupparsi con 
successo nelle condizioni restrittive di tali habitat [Georlette et al 2003]. Alcuni di questi 
organismi, a seconda della temperatura ottimale di crescita, sono inoltre conosciuti con il 
termine di psicrotolleranti o i psicrotropi [D’Amico et al. 2006].  
Gli organismi psicrofili hanno quindi sviluppato strategie di adattamento che permettono loro 
la sopravvivenza attraverso processi metabolici compatibili con la vita che si avvicinano il più 
possibile a quelli dell'organismo temperato [Georlette et al. 2003]. I microrganismi psicrofili 
possiedono infatti un metabolismo vitale anche in condizioni di ghiaccio e neve fino alla 
temperatura di -20°C; sono stati inoltre isolati numerosi psicrofili  in grado di proliferare ad 
una temperatura inferiore o pari ai 0° C fino a temperature intorno a 30°C [Siddiqui, et al. 
2006]. 
Per riuscire a svilupparsi a temperature non permissive, gli organismi psicrofili hanno dovuto 
superare condizioni particolari a cui si deve far fronte nelle zone di freddo estremo e costante 
tra cui ridotta attività enzimatica, diminuzione della fluidità della membrana, riduzione del 
processo di trascrizione, traduzione e della divisione cellulare, denaturazione a freddo delle 
proteine e formazione di ghiaccio intracellulare.  
Per superare queste barriere gli organismi hanno provveduto aumentando, per esempio la 
concentrazione enzimatica in modo da compensare la bassa velocità delle reazioni, anche se 
questa strategia risulta essere molto dispendiosa a livello energetico. Un’altra ipotesi si basa 
sull’espressione di specifici isotipi adattati cineticamente a un dato ambiente; questo è 
particolarmente sfruttato nei meccanismi per l’adattamento stagionale reversibile. Infine 
un’altra alternativa per l’adattamento al freddo potrebbe essere lo sviluppo di enzimi con 
elevato potenziale catalitico indipendente dalla temperatura. 
Esistono inoltre strategie di adattamento al freddo a livello cellulare; ciò si riflette in alterazioni 
del metabolismo, della composizione della membrana e in cambiamenti nell’espressione dei 
geni. Alcuni organismi sottoposti a temperature molto basse sintetizzano per esempio 
particolari proteine dette cold shock protein; esse sono sintetizzate in grandi quantità e sono 
fondamentali per l’organismo per poter riattivare il meccanismo di crescita cellulare che viene 
notevolmente rallentato durante lo shock termico.
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Queste proteine possono fungere da aiuto nei processi di trascrizione e traduzione della cellula e 
possono funzionare come fattori trascrizionali, come proteine che legano DNA o ribosomi. 
Alcuni organismi, tra cui i pesci che popolano le acque alle alte latitudini, riescono a 
sopravvivere a temperature molto basse promuovendo la sintesi di proteine anticongelamento 
(antifreeze protein) che permettono di abbassare il punto di congelamento dell’acqua (-1.9° C). La 
bassa temperatura di congelamento dei pesci (-2° C) alquanto inusuale, è il risultato della 
presenza di soluti nell’acqua, ma soprattutto della presenza nel loro sangue di queste proteine 
anticongelamento. 
Una risposta universale alle basse temperature è il cambiamento della composizione lipidica 
della membrana. La membrana è costituita da fosfolipidi e proteine che svolgono importanti 
funzioni fisiologiche; nei fosfolipidi si trovano due tipi di acidi grassi: quelli saturi, in cui tutti i 
legami che gli atomi di carbonio possono formare sono saturati con atomi di idrogeno, e quelli 
insaturi, nei quali si formano doppi legami tra gli atomi di carbonio. La fluidità del doppio 
strato lipidico è in parte dovuta alla abbondanza relativa degli acidi grassi insaturi che 
provocano un maggiore disordine nell'allineamento delle catene, rendendo più fluida la 
membrana, mentre le catene sature con il loro allineamento più compatto favoriscono la 
formazione di un reticolo rigido. A seguito di un abbassamento della temperatura la 
composizione della membrana viene modificata: gli organismi infatti convertono le catene di 
acidi grassi saturi dei fosfolipidi preesistenti nella forma insatura. In questo modo la 
diminuzione di fluidità di membrana provocata dall’abbassamento di temperatura viene 
compensata dalla conversione nella forma insatura dei fosfolipidi di membrana che permettono 
un aumento della fluidità.