Studio e sviluppo di metodi robusti per la validazione automatica di miRNA

La vita di tutte le cellule, animali e vegetali, è legata in modo indissolubile alle proteine. Le proteine svolgono, infatti, un numero notevole di funzioni per gli esseri viventi, tra le quali, funzione energetica, strutturale, immunitaria, di trasporto (di ossigeno, metalli, lipidi, di membrana), di identificazione dell'identità genetica, ormonale, enzimatica e contrattile. Per il corretto svolgimento di queste funzioni all'interno della cellula, però, è necessario che le proteine siano presenti nella giusta quantità. Mentre per le proteine non prodotte dall'essere vivente ma assunte, la regolazione della quantità necessaria di proteine è semplice da pianificare mediante un particolare “dieta”, per le proteine prodotte dall'essere vivente mediante il processo di espressione genica, cioè il processo mediante il quale l'informazione contenuta in un gene del patrimonio genetico viene convertita in una proteina, esistono vari meccanismi di regolazione che possono, però, presentare errori e comportare malformazioni o disfunzioni di varia natura.
Per verificare, dunque, se alcuni particolari geni sono espressi regolarmente, cioè codificano la corretta quantità di proteine, oppure sono sovraespressi o ancora sono sottoespressi, cioè codificano, rispettivamente, una quantità maggiore o minore di proteine, esistono vari metodi quantitativi e/o qualitativi.
Uno dei metodi quantitativi per la determinazione del livello di espressione genica, il cui uso è in continua espansione, è la reazione a catena della polimerasi in real-time, nota con l'acronimo di real-time PCR (real-time Polymerase Chain Reaction). Tale tecnica è basata su un metodo di amplificazione (PCR) e quantificazione simultanee del DNA (si ricorda che i geni non sono altro che sequenze convenzionali di DNA). L'amplificazione, la PCR, ideata da Kary b. Mullis nel 1983, che per questo ha ottenuto il premio Nobel per la chimica nel 1993, è una tecnica di biologia molecolare che consente la moltiplicazione (amplificazione) di acidi nucleici, cioè dei “tasselli” di cui i geni si compongono.
In particolare, la PCR prevede dei cicli di amplificazione, ai termini dei quali la quantità di DNA prodotta è idealmente pari al doppio della quantità prodotta al ciclo precedente. La real-time PCR, inoltre, introduce una quantificazione del DNA prodotto ad ogni ciclo, grazie ad alcuni probe che emettono fluorescenza quando riconoscono la sequenza di acidi nucleici che si vuole amplificare. Dallo studio dell'andamento dei valori di fluorescenza registrati con apposite fotocamere e spettrometri, è possibile misurare in modo quantitativo il livello di espressione genica ciclo per ciclo durante l'amplificazione. I problemi più grandi, però, sorgono nell'analisi delle curve rappresentanti l'andamento dei valori di fluorescenza. Numerosi sono, infatti, nella letteratura scientifica i tentativi di trovare il metodo migliore e consistente per tale analisi. Inoltre, vista la notevole quantità di dati prodotti dalla strumentazione che realizza la real-time PCR, si rende necessaria un'automatizzazione dell'intero processo di analisi delle curve di fluorescenza. Molti dei metodi proposti, anche se automatizzabili, prevedono un massiccio uso dell'intervento umano nel setting di numerosi parametri, come per esempio l'impostazione del valore di soglia della fluorescenza. Ciò comporta una maggiore soggettività e un maggiore consumo di tempo per l'analisi dei dati. Nella letteratura scientifica, poi, si osserva anche una quasi totale mancanza di proposte di metodi che oltre ad analizzare i livelli di espressione genica, diano una valutazione dell'analisi stessa. Si rende, dunque, necessario proporre un metodo di analisi che automatizzi il processo di analisi senza necessitare dell'intervento umano e che valuti la correttezza dell'analisi stessa. In questa tesi si cerca proprio di raggiungere tale obiettivo in modo consistente e robusto. Inoltre, una volta terminata l’analisi di più esperimenti, si potrebbe rendere manifesta l’esigenza di effettuare un clustering, cioè un raggruppamento in base a determinati parametri, di tali esperimenti, per determinarne la natura. Ciò si rende necessario soprattutto nell’analisi di tipo unsupervised. In tale tipo di analisi la natura di alcuni o tutti i campioni su cui si effettua il clustering non è nota e grazie al clustering, dunque, si cerca di desumerne la natura. Anche tale tematica verrà sviluppata all’interno di questa tesi e si utilizzeranno strumenti grafici per una migliore comprensione dei risultati ottenuti.