Studio e sviluppo di metodi robusti per la validazione automatica di miRNA

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massiccio uso dell’intervento umano nel setting di numerosi parametri, come per 
esempio l’impostazione del valore di soglia della fluorescenza. Ci  comporta una 
maggiore soggettivit  e un maggiore consumo di temp o per l’analisi dei dati. Nella 
letteratura scientifica, poi, si osserva anche una quasi totale mancanza di proposte 
di metodi che oltre ad analizzare i livelli di espressione genica, diano una 
valutazione dell’analisi stessa. Si rende, dunque, necessario proporre un metodo di 
analisi che automatizzi il processo di analisi senza necessitare dell’intervento 
umano e che valuti la correttezza dell’analisi stessa. In questa tesi si cerca proprio 
di raggiungere tale obiettivo in modo consistente e robusto. Inoltre, una volta 
terminata l analisi di piø esperimenti, si potrebbe rendere manifesta l esigenza di 
effettuare un clustering, cioŁ un raggruppamento in base a determinati parametri, 
di tali esperimenti, per determinarne la natura. Ci  si rende necessario soprattutto 
nell analisi di tipo unsupervised. In tale tipo di analisi la natura di alcuni o tutti i 
campioni su cui si effettua il clustering non Ł nota e grazie al clustering, dunque, si 
cerca di desumerne la natura. Anche tale tematica verr  sviluppata all interno di 
questa tesi e si utilizzeranno strumenti grafici per una migliore comprensione dei 
risultati ottenuti. 
  
 Nel Capitolo 1 di questa tesi sono stati fatti alcuni richiami e introdotte alcune 
definizioni in merito a DNA, RNA, microRNA e clustering per rendere il piø 
accessibile possibile il metodo proposto anche dal punto di vista teorico. Si Ł, 
inoltre, presentata la strumentazione necessaria allo svolgimento della real-time 
PCR. 
 
Nel Capitolo 2, Ł presentato lo stato dell’arte attuale per quanto riguarda i metodi 
per l’analisi e per la quantificazione dei livelli di espressione genica mediante real-
time PCR. Viene inoltre illustrato lo stato dell arte riguardante la definizione del 
concetto di distanza e lo sviluppo di metodi di clustering. 
 
Nel Capitolo 3, Ł introdotto il metodo proposto da questa tesi, con esplicazione dei 
principi matematici e biologici utilizzati per lo sviluppo del metodo stesso. Inoltre 
sono presentati i dati su cui si Ł sperimentata la soluzione proposta. Una 
particolare attenzione Ł stata rivolta all’esplicazione della struttura dei dati 
intermedi ottenuti dalle elaborazioni parziali 
 
Nel Capitolo 4, sono riportati i risultati quantitativi e qualitativi ottenuti dalla 
sperimentazione, esempi di analisi e valutazione dell’analisi delle curve di 
fluorescenza e prove di clustering sugli esperimenti di cui si dispone. 
 
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Infine, nel Capitolo 5, sono riportate le conclusioni a cui si Ł giunti grazie alla 
sperimentazione del metodo proposto ed eventuali sviluppi futuri e migliorie da 
apportare al metodo stesso. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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Capitolo 1 
 
Definizioni e background 
 
La reazione a catena della polimerasi in real-time (real-time PCR) Ł una tecnica 
basata su un metodo di amplificazione e quantificazione simultanee del DNA. La 
real-time PCR, negli ultimi venti anni ha acquisito un’importanza sempre 
maggiore nello scenario della quantificazione dell’espressione genica, grazie anche 
al rapido avanzamento delle tecnologie coinvolte in tale tecnica. In particolare, 
sono stati impiegati nella fase di quantificazione prodotti sempre meno pericolosi 
e tossici per l’uomo e sono stati sensibilmente decrementati i tempi di esecuzione 
della reazione di amplificazione. A fronte di una tecnica sviluppata qual Ł la real-
time PCR, l’analisi automatica dei dati prodotti da tale reazione deve, invece, 
essere resa maggiormente robusta e consistente. 
 
1.1  Elementi biologici  
 
Verranno ora richiamati concetti e definizioni di biologia molecolare necessari per 
una maggiore comprensione della tesi, ed in particolare dei principi di 
funzionamento della real-time PCR e dei concetti alla base del metodo proposto. 
 
1.1.1 Espressione genica 
 
L’espressione genica Ł il processo attraverso cui l’informazione contenuta in un 
gene (costituita di DNA) viene convertita in una macromolecola funzionale 
(tipicamente una proteina, ma anche un altro tipo di acido nucleico, come alcuni 
RNA, per esempio i microRNA, che non vengono tradotti in proteine). 
L’espressione genica Ł finemente regolata dalla celula. Tutti i passaggi 
dell’espressione genica possono essere modulati, a partire dal passaggio della 
trascrizione del DNA ad RNA, fino alle modificazioni post-traduzionali della 
proteina prodotta. La regolazione dell’espressione genica Ł fondamentale per la 
cellula, perchØ le permette di controllare le proprie funzioni interne ed esterne, 
come la differenziazione cellulare, la morfogenesi o i vari processi di adattamento 
alle necessit  dell’organismo [1].  
 
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1.1.2  DNA 
 
L’acido desossiribonucleico (DNA) Ł la molecola alla base della vita degli 
organismi cellulari e acellulari come i virus. Il DNA Ł composto da sole quattro 
molecole fondamentali chiamate neuclotidi, identiche tranne per il fatto di 
contenere ciascuna una differente base azotata. Ciascuno di questi nucleotidi 
contiene un fosfato, uno zucchero pentoso (il desossiribosio) e una delle quattro 
basi. In assenza del gruppo fosfato, la base e il dessosiribosio formano un 
composto che viene chiamato nucleoside. Le quattro basi sono la adenina (A), la 
guanina (G), la citosina (C) e la timina (T)     (Fig. 1.1). Solitamente quando ci si 
riferisce ad un nucleotide, si indica l’abbreviazione della sua base. Da un punto di 
vista strutturale, le basi, sono a due a due, simili: da una parte adenina e guanina, 
chiamate purine e dall’altra citosina e timina, chiamate pirimidine [2]. 
 
 
 
 
 
 
 
Il modello della struttura del DNA, sviluppato da James Watson e Francis Crick 
nel 1953,  vede il DNA come una doppia elica costituita da due catene di 
nucleotidi (detti anche filamenti o strand), che vengono denominate 5’ 
 3’ e  
3’ 
 5’ perchŁ esse corrono in direzioni opposte (antiparallele). I nucleotidi di un 
filamento sono uniti da legami fosfodiesterici, nei quali un gruppo fosfato forma 
un ponte tra gruppi -OH di due residui adiacenti di zucchero. I due filamenti, a 
loro volta, sono tenuti insieme dai legami idrogeno che si costituiscono tra le basi 
per la presenza di due atomi elettronegativi che "condividono" un protone. I 
Figura 1.1  Le basi azotate presenti nel DNA e nell’RNA  suddivise in purine e pirimidine 
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legami idrogeno sono piuttosto deboli (20 kJ / mol a temperatura ambiente 
nell’acqua pura), ma diventano piø forti se gli atomi che partecipano al legame 
idrogeno sono disposti secondo un orientamento ideale, cioŁ sono "puntati" uno di 
fronte all’altro. Piø precisamente si parla di appaiamento delle basi, e gli unici 
possibili appaiamenti che si possono trovare nel DNA sono T con A e C con G 
(Fig.1.2). In particolare la coppia C-G ha tre legami idrogeno, mentre la coppia A-
T solo due. Si pu  quindi dedurre  che una molecola  di DNA che contenga molte 
coppie C-G Ł piø stabile di una molecola che contiene molte coppie A-T. 
La struttura del DNA quindi, permette di capire il modo in cui la molecola pu  
essere duplicata o replicata perchŁ ciascuna base pu  specificare la sua base 
complementare per mezzo del legame idrogeno.  
 
 
 
 
 
 
La molecola del DNA Ł di fondamentale importanza per la genetica poichŁ essa 
costituisce la base fondamentale dei geni. I geni, infatti, non sono altro che 
sequenze di acidi nucleici  che servono a  codificare per un RNA, il quale a sua 
volta pu  codificare per una proteina. Infatti, anc he se la maggior parte dei geni 
codifica per proteine, alcuni geni specificano RNA che non danno origine a 
proteine, ma servono, per esempio, per la regolazione dell’espressione genica 
come nel caso dei microRNA. 
 
(a) (b) 
Figura 1.2 (a) Struttura chimica del DNA a doppio filamento con indicazione dei legami   
                   idrogeno;  (b) struttura tridimensionale del DNA a doppio filamento [3] 
 
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1.1.3 cDNA 
 
Il DNA complementare (cDNA) Ł un DNA a doppia elica (anche detto double-
stranded DNA o ds-DNA), sintetizzato a partire da un campione di RNA 
messaggero maturo. 
Per produrre il cDNA si sintetizzano i due filamenti in due passaggi: il primo Ł 
prodotto utilizzando l’RNA messaggero (mRNA) come stampo, mentre il secondo 
Ł sintetizzato a partire dal primo filamento prodotto (Fig.1.3). Per la sintesi del 
filamento stampo, complementare alla sequenza di mRNA, si utilizza l’enzima 
trascrittasi inversa. Questo enzima opera su un singolo filamento di RNA, 
generando il suo DNA complementare basandosi sull’appaiamento delle basi 
azotate dell’RNA (A,U,G,C) con quelle complementari del DNA (T, A, C, G 
rispettivamente). 
 
 
 
 
 
All’interno di questa tesi, la produzione di cDNA a partire da RNA (piø 
dettagliatamente da microRNA) tramite trascrittasi inversa Ł di fondamentale 
importanza per l’esecuzione della Polymerase Chain Reaction in real-time (real-
time PCR). 
 
 
 
 
Figura 1.3 Sintesi del cDNA a doppio filamento a partire da mRNA [4].  
 
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1.1.4   RNA 
 
L’acido ribonucleico (RNA) Ł una macromolecola di acido nucleico molto simile 
al DNA ma possiede propriet  molto differenti.In pr imo luogo, l’RNA Ł a singolo 
filamento e non a doppia elica (Fig.1. 4). L’RNA, inoltre, contiene nei suoi 
nucleotidi lo zucchero ribosio invece del desossiribosio (Fig 1.5). 
Infine, contiene la base pirimidinica uracile (U) al posto della timina, capace di 
formare esattamente come la timina, legami idrogeno con l’adenina. 
 
 
 
 
 
 
Figura 1.4 Struttura tridimensionale dell’RNA messa a confronto con la   
      struttura tridimensionale del DNA. 
Figura 1.5   Il ribosio e il desossiribosio, gli zuccheri che danno il  
                 nome alle due molecole rispettivamente di RNA e DNA.