Ingegnerizzazione di mutanti di batteri rossi non sulfurei per lo sviluppo di processi fermentativi idonei alla produzione di H2

Quale alternativa ai combustibili fossili l’idrogeno (H2) è considerato un interessante vettore energetico. La produzione di H2 può essere effettuata sfruttando metodologie sia industriali che biologiche anche se la quantità di idrogeno prodotto per via biologica è inferiore a quello prodotto per via industriale. Fra i metodi biologici vi è la produzione
di H2 mediante un sistema misto, sfruttatato nella degradazione dei rifiuti secondo un procedimento a due fasi, una fermentazione al buio condotta da batteri non fotosintetici seguita da fotofermentazione con batteri fotosintetici rossi.
Fra i batteri fotosintetici rossi utilizzati nel secondo stadio vi è Rhodopseudomonas palustris, un microrganismo dotato di un metabolismo estremamente versatile. La sua flessibilità gli permette di crescere sia in condizioni di aereobiosi che di anaereobiosi e su di un ampia gamma di substrati organici, fra cui anche composti aromatici tossici.
Tale caratteristica lo rende particolarmente adatto all’applicazione su rifiuti industriali.
La produzione di H2 in R. palustris è catalizzata dall’enzima nitrogenasi, presente nel batterio in tre differenti isoforme, ciascuna delle quali possiede un diverso ione metallico nel sito attivo (Fe, V, Mo). Il tasso di produzione di H2 dato dalla nitrogenasi codificata dai geni nif, isoforma attiva in condizioni di crescita normali, è massimo su terreni senza ammonio e azoto, in condizioni di anaereobiosi e di irradiazione luminosa
appropriata. All’interno della cellula di R. palustris vi è, però, un meccanismo di consumo dell’H2 prodotto per riciclarne il potere riducente ad opera della idrogenasi “uptake” (hup), enzima che catalizza l’ossidazione dell’idrogeno molecolare.
Scopo del lavoro di tesi è l’ingegnerizzazione di ceppi di R. palustris al fine di incrementare il tasso di produzione di idrogeno. Con la presente sperimentazione siamo riusciti a inattivare l’idrogenasi “uptake” mutagenizzandola; sono inoltre in corso
esperimenti volti ad incrementare l’espressione delle nitrogenasi.
Le subunità catalitiche dell’idrogenasi, codificate dai geni hupS e hupL, sono state amplificate mediante PCR sia singolarmente che in associazione e successivamente clonate. Al loro interno è stata inserita una cassetta genica codificante per la resistenza alla kanamicina, dopo averla escissa da un altro plasmide. I frammenti genici codificanti
per le subunità catalitiche con all’interno la cassetta genica sono stati poi subclonati in due tipi di vettori per la trasformazione. Due ceppi di R. palustris sono stati trasformati mediante elettroporazione con plasmide pGEM o coniugazione extraparentale con un opportuno vettore suicida. Grazie al sequenziamento è stata poi controllata l’avvenuta
inserzione.
Parallelamente si stanno costruendo delle librerie dell’intero genoma dei ceppi con fosmidi e plasmidi pUC18 per isolare i geni delle nitrogenasi, non essendo stato possibile clonare questi geni per PCR data l’elevata variabilità di sequenza e la scarsità delle sequenze depositate. Dopo sequenziamento di vari frammenti genici e di parte del gene ribosomiale 16S si è infatti vista una variabilità di sequenza di circa il 3% rispetto
alle sequenze depositate. Si è prodotta anche una sonda codificante per parte del gene nifE per lo screening delle librerie.
Passaggi successivi saranno l’individuazione dei geni per le nitrogenasi, la loro overespressione e la creazione di doppi mutanti per l’inattivazione di entrambe le subunità catalitiche dell’idrogenasi.