Studio delle proprietà termodinamiche e morfologiche di domini in monostrati fosfolipidici

Lo scopo di questo lavoro di tesi è stato lo studio del comportamento morfologico e termodinamico di monostrati di fosfolipidi. Tali monostrati sono da considerarsi come un'utile modello di un doppio strato fosfolipidico, e quindi uno strumento per la comprensione delle leggi che regolano il comportamento delle membrane cellulari.
La membrana cellulare è un sottile rivestimento che delimita la cellula in tutti gli organismi viventi, la separa con l'ambiente esterno e ne regola gli scambi con questo.
Formato in prevalenza da lipidi, e più precisamente fosfolipidi, il doppio strato lipidico rappresenta anche l’ambiente in cui si vanno a collocare le proteine di membrana e con cui altre proteine, dette periferiche, interagiscono.
Il modello a mosaico fluido è un modello della struttura della membrana cellulare proposto nel 1972 da Singer e Nicolson. Questo modello è stato successivamente rivisto (da Simon e Ikonen, nel 1997) in favore di un modello di membrana in cui all'interno del doppio strato lipidico fluido esistono zone rese meno fluide dalla presenza di sfingolipidi e colesterolo allo stato liquido. Tali zone, dette anche “lipid rafts”, agirebbero come piattaforme per l'aggregazione delle proteine e la comunicazione cellulare. In generale, i modelli attuali di doppio strato lipidico considerano la presenza di una notevole eterogeneità nella sua struttura.
Ovviamente in natura la membrana plasmatica è formata da una varietà di fosfolipidi con caratteristiche diverse; in questo lavoro sono state studiate le caratteristiche di due fosfolipidi in particolare: POPE (1-Palmitoyl-2-Oleoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine) e POPG (1-Palmitoyl-2-Oleoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholine).
Il POPE ed il POPG sono stati usati in una grande numero di lavori sperimentali. Il POPE è infatti uno dei componenti principali della membrana dei globuli rossi e soprattutto rappresenta la componente principale delle membrane batteriche. Dal punto di vista funzionale è inoltre implicato nel corretto funzionamento di molte proteine di membrana. Il POPG risulta molto abbondante nelle membrana plasmatica di microorganismi e nella membrana dei cloroplasti delle piante.
Tali monostrati fosfolipidici sono stati caratterizzati tramite studi termodinamici all'interfaccia. La struttura del monostrato lipidico è stata caratterizzata mediante deposizione su supporto solido utilizzando la tecnica di Langmuir-Blodgett ed imaging con microscopia a forza atomica.
Lo studio dei monostrati fosfolipidici all’interfaccia è stato realizzato mediante la tecnica di Langmuir-Blodgett, tramite l'uso di un Langmuir Trough abbinato ad un bagno termostatato. La tecnica di Langmuir-Blodgett permette di creare un monostrato di fosfolipidi all'interfaccia aria-acqua, mantenendo il controllo della pressione superficiale (ricavata dalla tensione superficiale) e della temperatura, e di trasferirlo successivamente su di un supporto solido.
Tali monostrati sono stati successivamente osservati tramite microscopia AFM (Atomic Force Microscopy) che permette di ottenere la struttura tridimensionale con risoluzione nanometrica (diversamente dalle comuni tecniche di microscopia ottica in cui la risoluzione laterale è limitata all’ordine del micrometro e non viene fornita la struttura tridimensionale).
Controllando la pressione superficiale di film di fosfolipidi all’interfaccia aria/acqua è possibile indurre transizioni di fase del film. A basse pressioni i lipidi interagiranno debolmente tra loro e la conformazione della catena idrofobica sarà prevalentemente disordinata. In questa situazione i lipidi si trovano nella fase liquido espansa. All’aumentare della pressione i fosfolipidi tenderanno ad interagire maggiormente e la componente idrofobica assumerà una struttura più ordinata: si troveranno quindi in fase liquido condensata.
L’utilizzo di tali strumenti ha permesso l'osservazione della formazione e della struttura di domini di fosfolipidi nella regione di coesistenza Liquido Espanso/Liquido Condensato al variare dei parametri termodinamici tensione superficiale e temperatura.
L’obiettivo del mio lavoro è stato quello di comprendere la rilevanza della prossimità del punto critico sulla struttura di tali domini. In prossimità di un punto critico si possono infatti ottenere le condizioni in cui la tensione di linea, la quale contribuisce a determinare la morfologia dei domini lipidici, tende a zero. In questo caso le fluttuazioni a livello nanometrico della struttura dei domini vengono esaltate. I dati ottenuti mostrano come al variare dei parametri termodinamici di ottenimento del monostrato lipidico i domini di fase liquido condensata assumono una morfologia diversa, con una tendenza ad assumere una struttura laterale su scala nanometrica.
La presenza di un punto critico è stata considerata rilevante anche nel caso di membrane biologiche in merito alla formazione di "lipid rafts" su scala nanometrica.